Ст 38 ск рф с комментариями: Статья 38 СК РФ и комментарии к ней

Ст. 38 СК РФ «Раздел общего имущества супругов» с комментариями :: BusinessMan.ru

Семейное законодательство в России было создано в целях защиты семьи, а также прав, интересов и свобод каждого ее члена. Немаловажную роль здесь играют имущественные вопросы. Довольно часто супруги ссорятся из-за того, что они не способны поделить все, что нажили за время брака. Чтобы решить подобные споры, необходимо обратиться к ст. 38 СК. Именно в ней указываются все особенности разделения совместного имущества. На что обратить внимание? Какие нюансы должны учесть супруги? Ответы на все эти вопросы будут предложены вниманию ниже. На самом деле все не так трудно, как кажется.

Понятие совместного имущества

Для начала, давайте разберемся с терминологией, которую будем использовать. Подобным словосочетанием характеризуют все имущество, приобретенное за общие денежные средства семьи, а также собственность, купленную в браке. При этом не важно, на кого она оформлена. Главное условие здесь — покупка чего-либо после официального оформления отношений.

Также в браке у супругов может быть личное имущество. Это:

• все, что было подарено конкретному человеку;
• предметы и имущество, полученное до вступления в брак;
• вещи личного пользования.

Что еще необходимо знать? Какие особенности включает в себя ст. 38 СК РФ?

Основы раздела имущества

Никаких непонятных норм Российское законодательство в изучаемой сфере не имеет. Исходя из предложенных законов, можно заметить, что 38 статья «Кодекса» указывает на возможность раздела совместной собственности в любое время.

Иными словами, муж с женой способны поделить общее имущество как в браке (не важно, когда именно), так и после развода. Кроме того, подобная операция будет доступна по заявлению кредитора, если необходимо взыскать с одного из супругов задолженность.

Споры и мир

Ст. 38 СК РФ подчеркивает, что муж и жена могут разделить совместное имущество по личной договоренности. Для того чтобы сделать это, во время брака потребуется у нотариуса заключить соответствующее соглашение. Им может являться:

• брачное соглашение;
• договор о разделении имущества.

В первом случае документ регулирует основы разделения как уже имеющейся собственности, так и всего, что будет нажито в будущем. Во втором, действие бумаги распространится только на уже имеющееся имущество.

П.3 ст. 38 СК РФ указывает на то, что при имущественных спорах раздел собственности будет происходить в суде. Уполномоченный орган выделит доли в том или ином имуществе, а также определит, кому и что будет принадлежать.

В случае если доля одного из супругов значительно превышает долю другого, возможна денежная компенсация тому, кто обделен.

Раздельное проживание

Иногда бывает так, что супруги не развелись, но по ряду причин проживают отдельно друг от друга. В п. 4 ст. 38 СК РФ прописаны особенности раздела имущества, приобретенного мужем и женой при подобных обстоятельствах.

Суд может признать собственность, купленную в период раздельного проживания, личным имуществом того, на кого она оформлена. Такое правило действует при расторжении брака.

Особенности разделения

Следует также учесть, что супруги покупают предметы не только для личного пользования, но и для детей. В ст. 38 СК содержатся пункты, указывающие на то, как делится подобное имущество.

Предметы, которые были куплены только для удовлетворения детских потребностей (одежда, книги, игрушки, обувь, инструменты и так далее), признаются собственностью несовершеннолетних. Такое имущество не подлежит разделу, так как к мужу и жене оно не имеет никакого отношения.

Все вклады, которые стороны внесли за счет общей собственности на имена общих несовершеннолетних детей, тоже не разделяются. Почему? Потому что они признаются имуществом детей.

Остаточные вещи

Бывает так, что супруги делят имущество, а потом наживают новое. Все, что было не разделено между женой и мужем, признается совместной собственностью. Точно так же, как и вся собственность, которая будет куплена за время брака в будущем.

Исключение составляют случаи с оформлением брачного контракта. Там прописывают, как уже было сказано, все особенности разделения имеющейся и будущей собственности. Все, что разделу не подлежало (за исключением личного имущества), — это общее имущество жены и мужа.

Исковая давность

Что еще предусматривается ст. 38 СК РФ? Имущество, признанное общим, можно разделять как в браке, так и после его расторжения. Но в России существует срок давности обращений за данной операцией.

Требования бывших супругов относительно вопроса разделения собственности имеют исковую давность. В данный момент у бывших супругов есть в запасе 3 года. Что это значит?

На протяжении 3 лет с момента развода муж/жена могут обратиться в суд для разделения совместной собственности.

Комментарии

Чтобы максимально точно изучить предложенную тему, необходимо прочесть ст. 38 СК РФ с комментариями. В ней будут даны некоторые уточнения, способные прояснить ситуацию в спорных вопросах.

Например, некоторым непонятно, когда начинает истекать срок давности по иску, связанному с разделом совместной собственности. Кто-то уверяет, что период начинается с даты, указанной при разрыве брачных уз. На самом деле это не так. Трехлетний срок отсчитывается со дня, в который истец мог узнать о нарушении своих прав на имущество.

Можно сказать, что в соответствии со ст. 38 СК, исковая давность имеет место с момента препятствования пользованию той или иной совместной собственностью.

Сначала — вложения, потом — собственность

Теперь о немного спорных вопросах. Например, как быть, если супруги купили жилой дом, который на момент расторжения брака не был оформлен в собственность? После развода владельцем стала одна из сторон.

Судебная практика по ст. 38 СК РФ подчеркивает, что при подобных обстоятельствах оба супруга имеют право на долю в доме. Он или незавершенный объект признается общей собственностью мужа и жены.

Долги

А как быть, если за время семейной жизни у сторон образовались задолженности? Что гласит ст. 38 СК?

Долги при разводе, как правило, делятся пополам. Исключение составляют задолженности, образовавшиеся за каждой стороной до вступления в брак. В данной ситуации каждый супруг сам выплачивает свою долю долга.

Если кредит был взят после свадьбы, то он, как уже было сказано, разделяется между женой и мужем. Но бывают исключения. В ст. 38 СК не указывается, но в целом Семейный Кодекс предусматривает наличие разрешения от второго супруга на взятие кредита/займа. Если такого соглашения нет, можно обраться в суд и признать операцию недействительной. Тогда судебные органы могут оставить задолженность тому, кто взял на себя кредит.

Вообще, ситуация с задолженностями супругов неоднозначна. Все зависит от обстоятельств дела. Суд может признать долг как общим, так и принадлежащим одной из сторон, в зависимости от предоставленных документов и чеков.

О брачном контракте

Следуя п. 2 ст. 38 СК РФ, жена и муж могут в любое время заключить договор о присвоении имущества или подписать брачный контракт. В целом, данные документы оформляются одинаково. Разница между ними уже была указана ранее.

Чтобы оформить брачный договор, нужно:

1. Составить текст соглашения. При этом важно учитывать действующее законодательство. Рекомендуется прописать особенности разделения имущества, нажитого в браке, — как текущего, так и будущего.
2. Подготовить документы о правах собственности на те или иные объекты, паспорта сторон и свидетельство о браке.
3. Обратиться к нотариусу и подписать в его присутствии соглашение. Нотариальные услуги оплачиваются отдельно.

Как только нотариус удостоверится в законности документа и поставит свою подпись, можно радоваться — имущественные споры должны быть решены раз и навсегда. Тем не менее в России подобный прием не приветствуется. Брачные контракты зачастую расцениваются как признак недоверия к супругу. Поэтому основная масса населения руководствуется общими принципами ст. 38 СК.

Ипотека и кредиты

Сейчас многие семьи берут в браке кредиты и оформляют ипотеку. Это нужно для того, чтобы обзавестись дорогостоящими объектами. Например, квартирами или машинами. Как будет разделяться подобное имущество жены и мужа?

В ст. 38 СК не указаны никакие особенности относительно данного вопроса. Но судебная практика демонстрирует то, что все имущество, оформленное в кредит или ипотеку во время оформленных отношений, считается общим среди супругов. И не важно, на кого оно оформлено. Если же кредит/ипотека образовались до свадьбы, приобретенное имущество признается собственностью того, на кого оно оформлено.

Итоги

Теперь понятно, какие нормы и особенности имеет ст. 38 СК РФ. Имущество, приобретенное в браке, чаще всего признается совместным. И разделяется оно либо по обоюдному согласию мужа и жены, либо по суду. На практике встречается второй вариант развития событий.

Исключение может составить собственность, полученная:

• в качестве подарка;
• по наследству;
• путем купли-продажи за счет добрачных/наследственных финансов одного из брачующихся.

Соответственно, если жена получила в наследство деньги и купила на них квартиру, можно признать такое жилье личной собственностью. Но подобное решение доставит немало хлопот истцу. Супругам придется доказывать и подтверждать факт приобретения собственности за свои личные накопления.

Статья 256 ГК РФ с комментариями — Общая собственность супругов

1. Имущество, нажитое супругами во время брака, является их совместной собственностью, если договором между ними не установлен иной режим этого имущества.

2. Имущество, принадлежавшее каждому из супругов до вступления в брак, а также полученное одним из супругов во время брака в дар или в порядке наследования, является его собственностью.

Вещи индивидуального пользования (одежда, обувь и т.п.), за исключением драгоценностей и других предметов роскоши, хотя и приобретенные во время брака за счет общих средств супругов, признаются собственностью того супруга, который ими пользовался.

Имущество каждого из супругов может быть признано судом их совместной собственностью, если будет установлено, что в течение брака за счет общего имущества супругов или личного имущества другого супруга были произведены вложения, значительно увеличивающие стоимость этого имущества (капитальный ремонт, реконструкция, переоборудование и т.

п.). Настоящее правило не применяется, если брачным договором между супругами предусмотрено иное.

Исключительное право на результат интеллектуальной деятельности, принадлежащее автору такого результата (статья 1228), не входит в общее имущество супругов. Однако доходы, полученные от использования такого результата, являются совместной собственностью супругов, если брачным договором между ними не предусмотрено иное.

3. По обязательствам одного из супругов взыскание может быть обращено лишь на имущество, находящееся в его собственности, а также на его долю в общем имуществе супругов, которая причиталась бы ему при разделе этого имущества.

4. Правила определения долей супругов в общем имуществе при его разделе и порядок такого раздела устанавливаются семейным законодательством.

В случае смерти одного из супругов пережившему супругу принадлежит доля в праве на общее имущество супругов, равная одной второй, если иной размер доли не был определен брачным договором, совместным завещанием супругов, наследственным договором или решением суда.

Комментарий к статье 256 Гражданского Кодекса РФ

1. Правила ст. 256 ГК подлежат применению с учетом норм Семейного кодекса, закрепляющих имущественные права и обязанности супругов, в первую очередь сосредоточенных в гл. 7 «Законный режим имущества супругов», гл. 8 «Договорный режим имущества супругов» и гл. 9 «Ответственность супругов по обязательствам». В этих главах развиты и конкретизированы правовые установления ГК об имуществе супругов.

2. В ранее действовавшем семейно-брачном законодательстве имущество, нажитое супругами во время брака, относилось к их совместной собственности; имущество, принадлежавшее каждому из супругов до вступления в брак, а также полученное одним из супругов во время брака в дар или по наследству, относилось к раздельной собственности каждого из них.

Пункт 1 ст. 256 ГК, сохранив в виде общего правила для имущества, нажитого супругами во время брака, правовой режим совместной собственности, сопровождает его оговоркой: «Если договором между ними не установлен иной режим этого имущества». Тем самым была предоставлена возможность перейти от правового режима имущества супругов, предусмотренного в самом законе, на такой правовой режим, который устанавливали бы в договоре сами супруги. Первый режим получил название законного, а второй — договорного. По такому пути и пошел введенный в действие с 1 марта 1996 г. Семейный кодекс. Супругам предоставлено право, заключив брачный договор, изменить установленный законом режим совместной собственности (ст. 34 Семейного кодекса), установив режим совместной, долевой или раздельной собственности на все имущество супругов, на его отдельные виды или на имущество каждого из супругов. Он может быть заключен в отношении как имеющегося в наличии, так и будущего имущества супругов.

Брачный договор может быть заключен как до государственной регистрации брака, так и в любое время в период брака. Если договор заключен до регистрации брака, он вступает в силу со дня регистрации брака. Брачный договор заключается в письменной форме и подлежит нотариальному удостоверению.

Несоблюдение формы заключения брачного договора влечет его недействительность.

3. Как и ранее действовавшее законодательство, ГК и Семейный кодекс относят к раздельному имуществу каждого из супругов, во-первых, имущество, принадлежавшее каждому из них до вступления в брак, во-вторых, имущество, полученное одним из супругов в период брака в дар или по наследству; в-третьих, вещи индивидуального пользования (одежда, обувь, и т.п.), кроме драгоценностей и других предметов роскоши, хотя бы они и были приобретены в период брака за счет общих средств супругов (см. абз. 1 и 2 п. 2 ст. 256 ГК; ст. 36 Семейного кодекса). К раздельному имуществу следует отнести и приватизированную одним из супругов квартиру, если другой супруг, хотя и дал согласие на приватизацию, но ее участником быть не пожелал, либо супруги и после заключения брака продолжали проживать раздельно. Правовой режим этого имущества как раздельного в брачном договоре также может быть изменен (см. п. 1 ст. 42 Семейного кодекса).

На него в целом либо в части может быть распространен правовой режим общей собственности, совместной или долевой.

4. Абзац 3 п. 2 ст. 256 ГК, как и ст. 37 Семейного кодекса, определяет условия, при которых имущество каждого из супругов может быть признано их совместной собственностью. Для этого необходимо установить, что в период брака за счет общего имущества супругов или имущества либо труда другого супруга были произведены вложения, значительно увеличивающие стоимость указанного имущества (капитальный ремонт, реконструкция, переоборудование и т.п.). В абз. 3 п. 2 ст. 256 ГК эти положения сопровождаются оговоркой: «Настоящее правило не применяется, если договором между супругами предусмотрено иное». В ст. 37 Семейного кодекса она излишняя благодаря наличию в том же Кодексе п. 1 ст. 42.

5. Пункт 3 ст. 256 ГК, как и п. 1 ст. 45 Семейного кодекса, определяет порядок обращения взыскания на имущество одного из супругов по его обязательствам. Взыскание может быть обращено лишь на имущество, находящееся в собственности должника, а при недостаточности этого имущества — на долю в общем имуществе, которая причиталась бы супругу-должнику при разделе общего имущества.

6. В п. 2 ст. 45 Семейного кодекса предусмотрено, что по общим обязательствам супругов, а также по обязательствам каждого из них, если судом установлено, что все полученное по обязательствам одним из супругов использовано на нужды семьи, взыскание обращается на общее имущество супругов. При его недостаточности супруги отвечают по указанным обязательствам солидарно имуществом каждого из них.

Если приговором суда установлено, что общее имущество супругов приобретено или увеличено за счет средств, полученных одним из супругов преступным путем, взыскание может быть обращено соответственно на общее имущество супругов или его часть.

7. Пункт 4 ст. 256 ГК носит отсылочный характер. В нем предусмотрено, что правила определения долей супругов в общем имуществе при его разделе и порядок такого раздела устанавливаются Семейным кодексом. Здесь в первую очередь должны быть использованы ст. ст. 38 и 39 этого Кодекса.

Ст. 38 УПК РФ с Комментариями 2020-2021 года (новая редакция с последними изменениями)

1. Следователь является должностным лицом, уполномоченным в пределах компетенции, предусмотренной настоящим Кодексом, осуществлять предварительное следствие по уголовному делу.

2. Следователь уполномочен:

1) возбуждать уголовное дело в порядке, установленном настоящим Кодексом;

2) принимать уголовное дело к своему производству или передавать его руководителю следственного органа для направления по подследственности;

3) самостоятельно направлять ход расследования, принимать решение о производстве следственных и иных процессуальных действий, за исключением случаев, когда в соответствии с настоящим Кодексом требуется получение судебного решения или согласия руководителя следственного органа;

4) давать органу дознания в случаях и порядке, установленных настоящим Кодексом, обязательные для исполнения письменные поручения о проведении оперативно-розыскных мероприятий, производстве отдельных следственных действий, об исполнении постановлений о задержании, приводе, об аресте, о производстве иных процессуальных действий, а также получать содействие при их осуществлении;

5) обжаловать с согласия руководителя следственного органа в порядке, установленном частью четвертой статьи 221 настоящего Кодекса, решение прокурора об отмене постановления о возбуждении уголовного дела, о возвращении уголовного дела следователю для производства дополнительного следствия, изменения объема обвинения либо квалификации действий обвиняемых или пересоставления обвинительного заключения и устранения выявленных недостатков;

6) осуществлять иные полномочия, предусмотренные настоящим Кодексом.

3. В случае несогласия с требованиями прокурора об устранении нарушений федерального законодательства, допущенных в ходе предварительного следствия, следователь обязан представить свои письменные возражения руководителю следственного органа, который информирует об этом прокурора.

Комментарий к Ст. 38 УПК РФ

1. Пункт 1 комментируемой статьи частично воспроизводит определение, содержащееся в пункте 41 статьи 5 УПК РФ, согласно которому следователь — должностное лицо, уполномоченное осуществлять предварительное следствие по уголовному делу, а также иные полномочия, предусмотренные УПК.

2. Предварительное следствие в современной России производится следователями Следственного комитета РФ, следователями органов Федеральной службы безопасности, следователями органов внутренних дел и следователями органов по контролю за оборотом наркотических средств и психотропных веществ. Круг уголовных дел, расследование которых относится к компетенции следователей каждого из перечисленных ведомств, иначе говоря, подследственность, определяется статьей 151 УПК; он различен. Процессуальное же положение каждого следователя, т.е. его права и обязанности при работе по конкретному уголовному делу, абсолютно одинаково; но не зависит ни от его ведомственной принадлежности, ни от должности в рамках родового понятия «следователь» (младший следователь, следователь, старший следователь, следователь по особо важным делам, старший следователь по особо важным делам), ни от фактических обстоятельств дела, его сложности и объема работы.

Бесплатная юридическая консультация по телефонам:

3. Следователь процессуально самостоятелен. Он вправе без согласования с кем бы то ни было возбудить уголовное дело по своей подследственности, принять его к своему производству, определить направления расследования и произвести необходимые следственные действия по собиранию доказательств, принять и реализовать решения о применении мер процессуального принуждения либо, если этого требует УПК, возбудить соответствующее ходатайство о принятии такого решения перед судом или истребовать согласие начальника следственного органа.

4. По отношению к органу дознания следователь занимает более высокое положение в уголовном процессе и обладает определенной властью. По расследуемым им делам он вправе давать органам дознания поручения и указания о производстве розыскных и следственных действий и требовать от органов дознания содействия при производстве отдельных следственных действий. Такие поручения и указания следователя даются в письменном виде и являются для органов дознания обязательными. Не будь такого правила, следователь-одиночка в целом ряде случаев, прежде всего крупных и сложных дел об организованных групповых преступлениях, оказался бы не в состоянии выполнить свои обязанности. Ему, кабинетному юристу, не под силу, например, производство трудоемких обысков, выемок или задержаний подозреваемых, которые в наше время зачастую носят характер боевого столкновения.

5. В числе законоположений, характеризующих процессуальную самостоятельность следователя, особое место занимают те, что закреплены в пункте 5 части второй и в части третьей комментируемой статьи. Их общий смысл заключается в том, что в определенных случаях следователь вправе не согласиться с позицией прокурора, занимаемой последним по конкретному уголовному делу, находящемуся в производстве следователя. Эти положения новы и небесспорны. Из содержания части третьей комментируемой статьи явствует, что ни требования прокурора об устранении нарушений федерального законодательства, допущенных в ходе предварительного следствия, ни решение прокурора о возвращении следователю уголовного дела, поступившего с обвинительным заключением, больше не обязательны ни для следователя, ни для начальника следственного органа, в котором служит данный следователь. На указанные требования, не исполняя их, достаточно (через начальника следственного органа) просто ответить письменными возражениями, а в ответ на прокурорское постановление о возвращении уголовного дела для дополнительного следствия, изменения обвинения либо квалификации действий обвиняемых или пересоставления обвинительного заключения и устранения выявленных недостатков (см. пункт 2 части первой статьи 221 УПК), тоже не исполняя его, следователь при согласии руководителя следственного органа может перевести свои разногласия с прокурором в плоскость дальнейшей инстанционной конфронтации с прокуратурой. Так что если в ходе предварительного следствия допущены существенные нарушения УПК, повлиявшие на его итоги, но в споре между двумя органами уголовного преследования — ведомственным следственным аппаратом и прокуратурой — прокурор, например, района или области не был поддержан Генеральным прокурором РФ, ему предстоит принять на себя функцию государственного обвинителя по делу, следственные материалы которого он добросовестно и профессионально уже давно считает бракованными.

6. Кроме того, с согласия своего непосредственного начальника — руководителя следственного органа следователь вправе обжаловать вышестоящему прокурору наиболее важные, имеющие определяющее значение для судьбы уголовного дела процессуальные решения прокурора, осуществляющего надзор за досудебным производством по данному уголовному делу. Приведенный в пункте 5 части второй комментируемой статьи перечень таких решений является исчерпывающим. Их обжалование приостанавливает исполнение прокурорского решения до рассмотрения жалобы вышестоящим прокурором (часть пятая статьи 221 УПК), а решение данного прокурора может быть, в свою очередь, обжаловано вышестоящему прокурору, то есть — Генеральному. Его решение носит окончательный характер.

7. Наряду со следователем самостоятельным участником досудебного производства по уголовным делам является следователь-криминалист, который в УПК впервые упомянут и, таким образом, узаконен в 2008 г. (Федеральный закон от 2 декабря 2008 г. «О внесении изменений и дополнений в Уголовно-процессуальный кодекс Российской Федерации» // Российская газета. 2008. 5 дек.), когда в статье 5, определяющей основные понятия, которыми пользуется этот Кодекс, появился новый пункт 40.1, согласно которому следователь-криминалист — это должностное лицо, уполномоченное осуществлять предварительное следствие, а также участвовать по поручению руководителя следственного органа в производстве отдельных следственных и иных процессуальных действий или производить отдельные следственные и иные процессуальные действия без принятия уголовного дела к своему производству. В основе данного законоположения — многолетний опыт функционирования прокуроров-криминалистов в органах прокуратуры в период, когда прокурорам принадлежало право возбуждать уголовные дела и производить предварительное расследование. Главный смысл деятельности следователя-криминалиста заключается в том, что расследование по уголовному делу в целом или же частично оказывается в компетенции должностного лица, обладающего всей полнотой процессуальных полномочий следователя и одновременно углубленными знаниями и (или) опытом в области криминалистической техники, криминалистической тактики производства отдельных следственных действий или криминалистической методики расследования данного вида преступлений.

8. В условиях строительства демократического правового государства положение российского следователя привлекает пристальное внимание общества. Рассредоточенность следственного аппарата по четырем различным ведомствам, три из которых (МВД, ФСБ и ФСКН России) осуществляют оперативно-розыскную деятельность, заключает в себе проблему. Несмотря на провозглашаемую независимость, следователи, с одной стороны, подчинены начальнику следственного отдела, который обладает огромными процессуальными полномочиями «ведомственного прокурора», с другой — так или иначе зависят от руководителей соответствующих органов, в структуру которых они вмонтированы. И наконец, следователи в работе по конкретным уголовным делам недопустимо сближаются с оперативными работниками, что подрывает условия их объективности. Между тем по природе своей предварительное следствие относится к юстиции, оно отделено от судебного разбирательства уголовных дел лишь в целях более тщательной «проработки материала». Его включенность в ведомства, осуществляющие полицейские функции, — такая же аномалия, как если бы, например, к полиции были приписаны судьи. Сложившееся положение имеет глубокие исторические корни. Они произрастают из сущности советского тоталитарного государства и трагического прошлого нашего общества, в котором на протяжении многих десятилетий милиция, политический сыск, предварительное следствие, прокуратура, разведка, контрразведка и даже суды, будучи обособленными друг от друга лишь условно, для отвода глаз обывателя, составляли единый конвейерный агрегат, предназначенный на входе принимать всякого, кого сочтет нужным власть, а на выходе выдавать полностью сломленного изгоя общества (или не выдавать вообще). Коренное реформирование предварительного следствия в соответствии с истинным смыслом этого вида государственной деятельности — одна из крупнейших задач, без решения которой, как представляется, судебно-правовая реформа не может быть завершенной.

Раздел имущества супругов не прекращает режим их общей собственности для целей банкротства?

Приветствую!

Наткнулся на судебную практику, которая, если честно, привела меня в замешательство.

Практика связана с толкованием п.7 ст. 213.26 ФЗ «О несостоятельности (банкротстве)»:
Имущество гражданина, принадлежащее ему на праве общей собственности с супругом
(бывшим супругом), подлежит реализации в деле о банкротстве гражданина по общим правилам,предусмотренным настоящей статьей. В таких случаях супруг (бывший супруг) вправе участвоватьв деле о банкротстве гражданина при решении вопросов, связанных с реализацией общегоимущества. В конкурсную массу включается часть средств от реализации общего имуществасупругов (бывших супругов), соответствующая доле гражданина в таком имуществе, остальная часть этих средств выплачивается супругу (бывшему супругу). Если при этом у супругов имеются общие обязательства (в том числе при наличии солидарных обязательств либо предоставлении одним супругом за другого поручительства или залога), причитающаяся супругу (бывшему супругу) часть выручки выплачивается после выплаты за счет денег супруга (бывшего супруга) по этим общим обязательствам.

Существует несколько свежих актов судов кассационной инстанции, которые толкуют указанную норму таким образом, что вид общей собственности (совместная или долевая) для
целей применения вышеуказанной нормы – безразличен. То есть, даже если есть решение суда о разделе совместно нажитого имущества супругов, оно от этого общим имуществом быть не
перестает (тут не поспоришь), и поэтому продавать нужно не долю в праве, а весь объект.

Приведу цитату:
«В рассмотренном случае после раздела общего имущества бывших супругов Горюнова В.Н.
и Горюновой Г.Ф. в судебном порядке спорное имущество не перестало являться их общей
собственностью. Суд общей юрисдикции установил лишь иной вид общей собственности, а
именно вместо ранее действующего режима совместной собственности бывших супругов на
соответствующее имущество установлена долевая собственность. При этом положения пункта 7
статьи 213.26 Закона банкротстве, регулирующие особенности реализации общего имущества
гражданина-должника и его супруга (бывшего супруга), предписывают реализацию общего
имущества супругов вне зависимости от того, в совместной либо долевой собственности такое
имущество значится (соответствующей конкретизации в норме не приведено). То есть раздел
общего имущества с определением долей (без выделения самостоятельных объектов,
подлежащих передаче каждому из супругов, что имеет место в настоящем споре) влияет лишь на то, в какой пропорции будет разделена выручка от продажи в деле о банкротстве общего
имущества и какая часть из этой выручки будет причитаться супругу должника» (Постановление Арбитражного суда Волго-Вятского округа от 23.11.2020 N Ф01-13472/2020 по делу N А43-23795/2017).

Такая же мотивировка приводится и в иных судебных актах (см. напр. Постановление
Арбитражного суда Поволжского округа от 28.05.2020 N Ф06-26074/2017 по делу N А12-63529/2016; Постановление Арбитражного суда Дальневосточного округа от 03.06.2019 N Ф03-
2022/2019 по делу N А51-3905/2017).

Конечно, из буквального толкования нормы такой вывод сделать можно, но я считаю это в
корне неверным и опровергаемым систематическим толкованием нормативных актов.

Итак, мои контраргументы:
1) Ст. 256 ГК РФ под названием «Общая собственность супругов» устанавливает, что имущество, нажитое супругами во время брака, является их совместной собственностью, если брачным договором между ними не установлен иной режим этого имущества. То есть под термином «общая собственность супругов» по умолчанию имеется именно совместная собственность. Аналогичным образом указано в п. 2 ст. 34 СК РФ: к имуществу, нажитому супругами во время брака (общему имуществу супругов), относятся…

2) П.7 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 25.12.2018 N 48 «О некоторых вопросах,
связанных с особенностями формирования и распределения конкурсной массы в делах о
банкротстве граждан»: в деле о банкротстве гражданина-должника, по общему правилу,
подлежит реализации его личное имущество, а также имущество, принадлежащее ему и супругу (бывшему супругу) на праве общей собственности (пункт 7 статьи 213.26 Закона о банкротстве, пункты 1 и 2 статьи 34, статья 36 СК РФ). Здесь пленум также под общей собственностью имеет ввиду именно совместную собственность.

3) Если следовать приведенной логике судов кассационных инстанций, то может сложиться
следующая ситуация. Супруги разделили имущество, например, большой дом по ½ доли на
каждого, развелись. 5 лет живут на 2 семьи в доме. Муж не расплачивается с кредитом и впадает в банкротство. В процедуре дом должен продаваться целиком, т.к. он продолжает оставаться общей собственностью бывших супругов? По указанной логике – да.

Другой пример. Два лица не были связаны друг с другом браком. Но у них было у каждого по ½ доли в праве собственности на квартиру. После вступления в брак эта квартира стала общим
имуществом. Супруг признается банкротом. Квартира должна продаваться целиком, ведь это
общая собственность супругов.

При этом, если объект недвижимости находится в долевой собственности лиц, не связанных
браком (и не состоявших в нем ранее), то он целиком продаваться не будет, что нарушает
принцип равенства участников гражданских отношений (ст. 1 ГК РФ).

По моему мнению, приведенная мотивировка судов кассационных инстанций является
ошибочной, основана на буквальном прочтении закона и фактически позволяет обращать
взыскание по обязательствам одного лица на личное имущество третьего лица.

Ваше мнение, коллеги?

 

В каком случае у родителей могут отобрать ребенка?

7 декабря 2020

У родителей могут отобрать ребенка при непосредственной угрозе его жизни или здоровью.

Материнство и детство, семья находятся под защитой государства. Забота о детях, их воспитание – равное право и обязанность родителей (ст. 38 Конституции РФ).

В соответствии со ст. 77 Семейного кодекса Российской Федерации основным и единственным способом защиты ребенка при непосредственной угрозе его жизни и здоровью является его немедленное отобрание у родителей (одного из них) или у других лиц, на попечении которых он находится.

Немедленное отобрание ребенка производится органом опеки и попечительства на основании соответствующего акта органа исполнительной власти субъекта Российской Федерации, либо акта главы муниципального образования в случае, если законом субъекта Российской Федерации органы местного самоуправления наделены полномочиями по опеке и попечительству в соответствии с федеральными законами.

При отобрании ребенка орган опеки и попечительства обязан незамедлительно уведомить прокурора, обеспечить временное устройство ребенка, в течение семи дней после вынесения уполномоченными органами акта об отобрании ребенка – обратиться в суд с иском о лишении родителей родительских прав или об ограничении их в родительских правах.

В соответствии с Постановлением Пленума Верховного Суда Российской Федерации от 14.11.2017 № 44 «О практике применения судами законодательства при разрешении споров, связанных с защитой прав и законных интересов ребенка при непосредственной угрозе его жизни и здоровью, а также при ограничении и лишении родительских прав» под непосредственной угрозой жизни или здоровью ребенка, которая может явиться основанием для вынесения акта о немедленном отобрании ребенка и изъятии его из семьи, следует понимать угрозу, с очевидностью свидетельствующую о реальной возможности наступления негативных последствий в виде смерти, причинения вреда физическому или психическому здоровью ребенка вследствие поведения (действий или бездействия) родителей (одного из них) либо иных лиц, на попечении которых ребенок находится. Такие последствия могут быть вызваны, в частности, отсутствием ухода за ребенком, отвечающего физиологическим потребностям ребенка в соответствии с его возрастом и состоянием здоровья (например, непредоставление малолетнему ребенку воды, питания, крова, неосуществление ухода за грудным ребенком либо оставление его на длительное время без присмотра).

Разрешение вопроса о немедленном отобрании ребенка на основании статьи 77 СК РФ отнесено к исключительной компетенции органа опеки и попечительства и производится во внесудебном порядке. Характер и степень опасности должны определяться в каждом конкретном случае с учетом возраста, состояния здоровья ребенка, а также иных обстоятельств.

Предусмотренная статьей 77 СК РФ мера по защите прав ребенка носит чрезвычайный характер, применение которой возможно в исключительных случаях, не терпящих отлагательств в связи с угрозой жизни или здоровью ребенка, и только на основании соответствующего акта органа исполнительной власти субъекта Российской Федерации либо главы муниципального образования, принятие которого влечет за собой временное прекращение права родителей (одного из них) либо иных лиц, на попечении которых ребенок находился, на личное воспитание ребенка (до рассмотрения судом заявления об ограничении родителей (одного из них) в родительских правах или о лишении их родительских прав, об отмене усыновления либо до разрешения органом опеки и попечительства вопроса об отстранении опекуна (попечителя), приемного родителя, патронатного воспитателя от выполнения своих обязанностей).

Тяжелое материальное положение семьи само по себе не является достаточным основанием для отобрания детей у родителей, если родители добросовестно исполняют свои обязанности по воспитанию детей, заботятся о них, создают необходимые условия для развития детей в соответствии с имеющимися материальными и финансовыми возможностями семьи.

Подготовлено прокуратурой Шиловского района

Вернуться к списку

В суде начинается бракоразводный процесс. Какое имущество супругов подлежит разделу при разводе? //

1. Согласно п.п. 1, 2 ст. 34 СК РФ имущество, нажитое супругами во время брака, является их совместной собственностью. К имуществу, нажитому супругами во время брака (общему имуществу супругов), относятся, в частности, доходы каждого из супругов от предпринимательской деятельности. Общим имуществом супругов являются также приобретенные за счет общих доходов супругов движимые и недвижимые вещи, ценные бумаги, паи, вклады, доли в капитале, внесенные в кредитные учреждения или в иные коммерческие организации, и любое другое нажитое супругами в период брака имущество независимо от того, на имя кого из супругов оно приобретено либо на имя кого или кем из супругов внесены денежные средства. Это имущество подлежит разделу в порядке ст. 38 СК РФ.

При этом, как разъяснил Пленум Верховного Суда РФ в п. 15 постановления от 5 ноября 1998 г. N 15 «О применении судами законодательства при рассмотрении дел о расторжении брака» (далее — Постановление N 15), в состав имущества, подлежащего разделу, включается общее имущество супругов, имеющееся у них в наличии на время рассмотрения дела либо находящееся у третьих лиц.

Таким образом, разделу подлежит только то имущество супругов, которое имеется на момент рассмотрения судом дела о разделе совместно нажитого имущества.

2. В соответствии с п. 1 ст. 34 СК РФ владение, пользование и распоряжение общим имуществом супругов должно осуществляться по их обоюдному согласию. Поэтому в случае когда при рассмотрении требования о разделе совместной собственности супругов будет установлено, что один из них произвел отчуждение общего имущества или израсходовал его по своему усмотрению вопреки воле другого супруга и не в интересах семьи, либо скрыл имущество, то при разделе учитывается это имущество или его стоимость (п. 16 Постановления N 15). В этой связи суды при разделе имущества обязывают супруга, израсходовавшего супружеские средства по своей инициативе, компенсировать другому супругу их половину (смотрите, например, апелляционное определение СК по гражданским делам Нижегородского областного суда от 28 марта 2017 г. по делу N 33-3493/2017, кассационное определение Санкт-Петербургского городского суда от 9 июня 2011 г. N 8782, апелляционное определение СК по гражданским делам Пермского краевого суда от 17 декабря 2014 г. по делу N 33-11437/14).

При этом в случае траты супругом денежных средств в период брака презюмируется их расходование на нужды семьи, вследствие чего компенсация не производится (смотрите, например, апелляционное определение СК по гражданским делам Московского городского суда от 24 апреля 2018 г. по делу N 33-18151/2018, определение СК по гражданским делам Верховного Суда РФ от 10 октября 2017 г. N 5-КГ17-118). Обратное должно быть доказано другим супругом (ч. 1 ст. 56 ГПК РФ).

3. Фактическое прекращение семейных отношений до расторжения брака в установленном порядке также влечет имущественные последствия для супругов. Так, согласно п. 4 ст. 38 СК РФ суд может признать имущество, нажитое каждым из супругов в период их раздельного проживания при прекращении семейных отношений, собственностью каждого из них (смотрите, например, определение СК по гражданским делам Верховного Суда РФ от 23 марта 2010 г. N 18-В10-1). А в соответствии с разъяснениями Пленума Верховного Суда РФ, если после фактического прекращения семейных отношений и ведения общего хозяйства супруги совместно имущество не приобретали, суд в соответствии с п. 4 ст. 38 СК РФ может произвести раздел лишь того имущества, которое являлось их общей совместной собственностью ко времени прекращения ведения общего хозяйства (п. 16 Постановления N 15).

Таким образом, в случае, если судом будет установлено фактическое прекращение супругами семейных отношений и ведения общего хозяйства*(1), то суд для раздела имущества между супругами будет проверять его наличие не на момент рассмотрения дела, а на момент прекращения ведения общего хозяйства.

При расходовании супругом имущества после этого момента подобное имущество также учитывается в разделе, поскольку фактическое прекращение семейных отношений не прекращает право общей собственности супругов на совместно нажитое имущество, а следовательно, распоряжение им должно осуществляться по их обоюдному согласию (п. 1 ст. 34 СК РФ). Однако с момента прекращения семейных отношений действует противоположная презумпция: предполагается, что трата осуществлена в собственных интересах супруга-растратчика, а не в интересах семьи, поэтому в отсутствие доказательств иного этого супруг должен компенсировать другому половину растраченных общих денежных средств (определение СК по гражданским делам Верховного Суда РФ от 16 мая 2017 г. N 24-КГ17-6).

  

Ответ подготовил:

Эксперт службы Правового консалтинга ГАРАНТ

  

Информационное правовое обеспечение ГАРАНТ

http://www.garant.ru

Многоканальный телефон: (347) 292-44-44

  

────────────────────────────────────────────────────────────────────────

*(1) Согласно ч. 3 ст. 196 ГПК РФ суд принимает решение по заявленным истцом требованиям. Сторона при этом несет бремя доказывания тех обстоятельств, на которые она ссылается как на основания своих требований и возражений (ч. 1 ст. 56 ГПК РФ).

  Соответственно, установление судом фактического прекращения супругами семейных отношений и ведения общего хозяйства возможно, если одним из супругов будет заявлено требование о признании имущества, нажитого им в период раздельного проживания супругов при прекращении семейных отношений, его личной собственностью либо требование о разделе лишь того имущества, которое являлось общей совместной собственностью супругов ко времени прекращения ведения общего хозяйства. В отсутствие таких требований, как нам представляется, суд должен рассматривать спор о разделе супружеского имущества по общим нормам СК РФ о том, что совместной собственностью является имущество, нажитое супругами в период брака (т.е. вплоть до расторжения брака в установленном порядке и с презумпцией его расходования в интересах семьи).

  

  

СК РФ: ст 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39

Глава 7. Законный режим имущества супругов

Статья 33. Понятие законного режима имущества супругов
1. Законным режимом имущества супругов является режим их совместной собственности.
Законный режим имущества супругов действует, если брачным договором не установлено иное.
2. Права супругов владеть, пользоваться и распоряжаться имуществом, являющимся совместной собственностью членов крестьянского (фермерского) хозяйства, определяются статьями 257 и 258 Гражданского кодекса Российской Федерации.

Статья 34. Совместная собственность супругов
1. Имущество, нажитое супругами во время брака, является их совместной собственностью.
2. К имуществу, нажитому супругами во время брака (общему имуществу супругов), относятся доходы каждого из супругов от трудовой деятельности, предпринимательской деятельности и результатов интеллектуальной деятельности, полученные ими пенсии, пособия, а также иные денежные выплаты, не имеющие специального целевого назначения (суммы материальной помощи, суммы, выплаченные в возмещение ущерба в связи с утратой трудоспособности вследствие увечья либо иного повреждения здоровья, и другие). Общим имуществом супругов являются также приобретенные за счет общих доходов супругов движимые и недвижимые вещи, ценные бумаги, паи, вклады, доли в капитале, внесенные в кредитные учреждения или в иные коммерческие организации, и любое другое нажитое супругами в период брака имущество независимо от того, на имя кого из супругов оно приобретено либо на имя кого или кем из супругов внесены денежные средства.
3. Право на общее имущество супругов принадлежит также супругу, который в период брака осуществлял ведение домашнего хозяйства, уход за детьми или по другим уважительным причинам не имел самостоятельного дохода.

Статья 35 Семейного кодекса — Ст 35 СК РФ

Статья 35. Владение, пользование и распоряжение общим имуществом супругов
1. Владение, пользование и распоряжение общим имуществом супругов осуществляются по обоюдному согласию супругов.
2. При совершении одним из супругов сделки по распоряжению общим имуществом супругов предполагается, что он действует с согласия другого супруга.
Сделка, совершенная одним из супругов по распоряжению общим имуществом супругов, может быть признана судом недействительной по мотивам отсутствия согласия другого супруга только по его требованию и только в случаях, если доказано, что другая сторона в сделке знала или заведомо должна была знать о несогласии другого супруга на совершение данной сделки.
3. Для заключения одним из супругов сделки по распоряжению имуществом, права на которое подлежат государственной регистрации, сделки, для которой законом установлена обязательная нотариальная форма, или сделки, подлежащей обязательной государственной регистрации, необходимо получить нотариально удостоверенное согласие другого супруга.
Супруг, чье нотариально удостоверенное согласие на совершение указанной сделки не было получено, вправе требовать признания сделки недействительной в судебном порядке в течение года со дня, когда он узнал или должен был узнать о совершении данной сделки.

Статья 36 Семейного кодекса — Ст 36 СК РФ

Статья 36. Имущество каждого из супругов
1. Имущество, принадлежавшее каждому из супругов до вступления в брак, а также имущество, полученное одним из супругов во время брака в дар, в порядке наследования или по иным безвозмездным сделкам (имущество каждого из супругов), является его собственностью.
2. Вещи индивидуального пользования (одежда, обувь и другие), за исключением драгоценностей и других предметов роскоши, хотя и приобретенные в период брака за счет общих средств супругов, признаются собственностью того супруга, который ими пользовался.
3. Исключительное право на результат интеллектуальной деятельности, созданный одним из супругов, принадлежит автору такого результата.

Статья 37 Семейного кодекса — Ст 37 СК РФ

Статья 37. Признание имущества каждого из супругов их совместной собственностью
Имущество каждого из супругов может быть признано судом их совместной собственностью, если будет установлено, что в период брака за счет общего имущества супругов или имущества каждого из супругов либо труда одного из супругов были произведены вложения, значительно увеличивающие стоимость этого имущества (капитальный ремонт, реконструкция, переоборудование и другие).

Статья 38 Семейного кодекса — Ст 38 СК РФ

Статья 38. Раздел общего имущества супругов

1. Раздел общего имущества супругов может быть произведен как в период брака, так и после его расторжения по требованию любого из супругов, а также в случае заявления кредитором требования о разделе общего имущества супругов для обращения взыскания на долю одного из супругов в общем имуществе супругов.
2. Общее имущество супругов может быть разделено между супругами по их соглашению. Соглашение о разделе общего имущества, нажитого супругами в период брака, должно быть нотариально удостоверено.
3. В случае спора раздел общего имущества супругов, а также определение долей супругов в этом имуществе производятся в судебном порядке.
При разделе общего имущества супругов суд по требованию супругов определяет, какое имущество подлежит передаче каждому из супругов. В случае, если одному из супругов передается имущество, стоимость которого превышает причитающуюся ему долю, другому супругу может быть присуждена соответствующая денежная или иная компенсация.
4. Суд может признать имущество, нажитое каждым из супругов в период их раздельного проживания при прекращении семейных отношений, собственностью каждого из них.
5. Вещи, приобретенные исключительно для удовлетворения потребностей несовершеннолетних детей (одежда, обувь, школьные и спортивные принадлежности, музыкальные инструменты, детская библиотека и другие), разделу не подлежат и передаются без компенсации тому из супругов, с которым проживают дети.
Вклады, внесенные супругами за счет общего имущества супругов на имя их общих несовершеннолетних детей, считаются принадлежащими этим детям и не учитываются при разделе общего имущества супругов.
6. В случае раздела общего имущества супругов в период брака та часть общего имущества супругов, которая не была разделена, а также имущество, нажитое супругами в период брака в дальнейшем, составляют их совместную собственность.
7. К требованиям супругов о разделе общего имущества супругов, брак которых расторгнут, применяется трехлетний срок исковой давности.

Статья 39 Семейного кодекса — Ст 39 СК РФ

Статья 39. Определение долей при разделе общего имущества супругов
1. При разделе общего имущества супругов и определении долей в этом имуществе доли супругов признаются равными, если иное не предусмотрено договором между супругами.
2. Суд вправе отступить от начала равенства долей супругов в их общем имуществе исходя из интересов несовершеннолетних детей и (или) исходя из заслуживающего внимания интереса одного из супругов, в частности, в случаях, если другой супруг не получал доходов по неуважительным причинам или расходовал общее имущество супругов в ущерб интересам семьи.
3. Общие долги супругов при разделе общего имущества супругов распределяются между супругами пропорционально присужденным им долям.

Искусственные клетки управляют нейронной дифференцировкой

РЕЗУЛЬТАТЫ

Искусственное клеточное шасси, разработанное для интеграции с эукариотическими клетками

Искусственные клетки были размещены в фосфолипидном пузырьке, который в основном состоял из 1-пальмитоил-2-олеоил- sn -глицеро- 3-фосфохолин (POPC) и холестерин. Искусственные клетки содержали механизмы транскрипции-трансляции и матрицы ДНК, которые кодировали нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), LuxR и перфринголизин O (PFO).BDNF является нейротрофическим фактором, который имеет решающее значение для развития и функционирования нервной системы, способствуя выживанию и дифференцировке нейронов, что приводит к разрастанию нейритов, ветвлению, формированию и стабилизации синапсов ( 13 — 16 ). Синтезированный внутрипузырно BDNF выходил из везикулы через поры белка. Мономерные субъединицы PFO экспрессировались в растворимой форме внутри искусственных клеток и собирались в олигомерные поры в присутствии холестеринсодержащих липидных мембран.Внешний диаметр гомодимера BDNF и поры PFO составляет 4 нм и 25-30 нм, соответственно ( 17 , 18 ). Следовательно, функциональные поры PFO позволяли выходить BDNF из искусственной клетки. Экспрессия PFO регулируется N, -3-оксогексаноил гомосеринлактон (3OC6 HSL) — реагирующим репрессором транскрипции LuxR. В этой схеме BDNF всегда синтезировался, но высвобождался из искусственной клетки только в присутствии 3OC6 HSL (рис. 1).

Инжир.1 Связь между искусственными и нервными стволовыми клетками.

Синтез мономеров PFO (светло-оранжевый) контролируется генетическим логическим элементом AND, который требует как LuxR, так и 3OC6 HSL для экспрессии гена. Мономеры PFO собираются в поры в присутствии холестеринсодержащих мембран, высвобождая BDNF. Гомодимеры зрелого BDNF (зеленый) действуют на родственный рецептор TrkB, активируя сигнальные пути, ведущие к дифференцировке и созреванию нервных стволовых клеток. Фигурка выполнена не в масштабе.

Физиологически совместимая платформа внеклеточной экспрессии

Новый in vitro состав аппарата транскрипции-трансляции был разработан и использован для всех описанных экспериментов. Токсичность различных систем экспрессии с самого начала проверяли с помощью высокочувствительного анализа коллапса ex vivo. Этот физиологически релевантный анализ измерял степень индуцированного токсичностью коллапса ведущего кончика аксонов, то есть конуса роста (рис. S1A). Экстракт клеток HeLa, лизат ретикулоцитов кролика и система PURE ( 19 ) увеличили коллапс конуса роста более чем в два раза (рис.S1A). Хотя неочищенный клеточный экстракт Escherichia coli S12 дал данные, аналогичные данным фосфатно-солевого буфера (PBS) (рис. S1A), осмоляльность полностью собранной реакции ( 20 ) была слишком высокой (около 500 мОсм / кг H ₂ O) (рис. S1C). Для сравнения, осмоляльность плазмы человека составляет от 285 до 305 мОсм / кг H ₂ О. Поэтому состав этого нетоксичного экстракта E. coli S12 был оптимизирован таким образом, чтобы поддерживать целостность искусственных клеток в физиологических условиях. (фиг.От S1 до S3).

Самодельная и оптимизированная бесклеточная система S12 использовалась для каждого эксперимента, за исключением этого начального скрининга токсичности с помощью анализа аксонального коллапса и скрининга условий реакции S12 (рис. S3, A и C, и S4, B, D и E). После первоначальной оценки условий реакции, отслеживаемых по экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) (фиг. S1C и S2, от A до E), промоторы транскрипции и концентрации матричной ДНК были оптимизированы для получения максимального количества BDNF и минимального количества LuxR и PFO с ограниченными ресурсами, доступными в искусственной ячейке (рис.S2, F и G). Следовательно, для экспрессии BDNF и LuxR использовали сильные и слабые промоторы транскрипции соответственно. В условиях конечного раствора использовалось значительно меньше каждого молекулярного компонента. Например, было использовано на 66% меньше аминокислот и на 33% меньше растворов для регенерации энергии по сравнению с обычно используемыми условиями (таблица S1) ( 20 ). Вероятны и другие оптимумы в химическом пространстве, как недавно показали машинное обучение и высокопроизводительный скрининг ( 21 ).

Искусственные клетки направляют дифференцировку нервных стволовых клеток

Искусственные клетки, построенные, как показано на рис. 1, способны влиять на дифференцировку и созревание нервных стволовых клеток (mNS), полученных из эмбриональных стволовых клеток мыши. В течение 19 дней искусственные клетки меняли каждые 24 часа, чтобы удовлетворить возрастающую потребность в BDNF во время дифференцировки клеток mNS. Поэтому старые искусственные клетки постоянно удалялись, а свежие искусственные клетки постоянно предоставлялись.В конце этого 19-дневного протокола in vitro (рис. 2A) клетки mNS показали четкие признаки дифференцировки в нейроны, о чем свидетельствует увеличение процента нейронов, сверхэкспрессирующих βIII-тубулин (рис. 2, B и C). ). Эффективность нейрональной дифференцировки определяли подсчетом нейрональных клеток с помощью иммуноокрашивания на пан-нейрональные и зрелые нейрональные маркеры βIII-тубулин и связанный с микротрубочками белок 2 (MAP2), соответственно. Перекрывающиеся сигналы MAP2 и βIII-тубулина подтвердили специфичность иммуноокрашивания βIII-тубулина и мечения зрелых нейронов (рис.2B и рис. S4A). И наоборот, когда искусственные клетки не были индуцированы для образования пор с 3OC6 HSL, фоновые уровни дифференцировки оставались такими же, как при инкубации с искусственными клетками, которые не синтезировали BDNF (разница ± 1%). Подобные фоновые уровни дифференцировки наблюдались, когда в среду для дифференцировки добавляли только PBS (21 ± 3% от общей популяции). Кроме того, BDNF, высвобождаемый искусственными клетками, ингибировал апоптоз (рис. S4, B и C), что согласуется с биологической активностью синтезированной сигнальной молекулы ( 22 ).При воздействии токсических условий во время дифференцировки нейронов мНС-клетки могут давать начало ненейрональным клеткам, то есть астроцитам ( 23 ). Однако такого эффекта не наблюдалось (рис. S4, D и E).

Рис. 2 Искусственные клетки управляют дифференцировкой нейронов.

( A ) Обзор искусственного лечения клеток и стратегии дифференцировки mNS-клеток. Слева: Обзор передачи сигналов между искусственными клетками и клетками mNS. В центре: искусственные клетки инкубировали с клетками mNS в течение 15 дней.Искусственные клетки смывали, и каждые 24 часа добавляли свежие искусственные клетки в свежей среде. На рисунке показан разрез колодца. Справа: В течение курса лечения искусственными клетками (дни с 4 по 19) количество искусственных клеток, секретирующих BDNF, постепенно увеличивалось. ( B ) Репрезентативная микроскопия иммуноокрашивания дифференцировки мНС-клеток в зрелые нейроны через 19 дней. Для нормализации использовали биологически неактивные искусственные клетки (секретирующие sfGFP, «Фон»).( C ) Статистический анализ мНС-клеток со сверхэкспрессией βIII-тубулина. Культуры, обработанные коммерческим BDNF (Com. BDNF), были взяты за эталон (100% активность, пунктирная линия). Данные из (B) были использованы для построения графика. Исходные данные представлены на рис. S4 (F и G). ( D ) Вестерн-блоттинг предварительно дифференцированных мНС-клеток в ответ на обработку искусственными клетками через 19 дней. Масштабные линейки, 50 мкм. Данные показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего для n = 3 биологических повтора, независимые эксперименты.Статистическим тестом был критерий Стьюдента t (непарный, двусторонний). См. Дополнительные материалы для подробного описания рисунков.

Если функциональность искусственных клеток была обусловлена ​​синтезом и высвобождением BDNF, то должна быть возможность обнаружить активацию BDNF-чувствительных сигнальных путей в нервных стволовых клетках. С этой целью культуры mNS-клеток дифференцировали в течение 18 дней в присутствии искусственных клеток и анализировали на активацию передачи сигналов киназы B (TrkB) –BDNF рецептора тропомиозина.Дифференцировку нейронов и фосфорилирование белков сигнального пути оценивали с помощью иммуноблоттинга для βIII-тубулина, фосфо-фосфолипазы Cγ1 (PLCγ1) и фосфо-ERK1 / 2 ^MAPK на 19-й день (рис. 2, A и D). Высвобождение BDNF из искусственных клеток индуцировало увеличение фосфорилированного PLCγ1 и ERK1 / 2 ^MAPK (нормализовано к общему PLCγ1 и общему ERK1 / 2 ^MAPK ) (фиг. 2D). Было обнаружено, что βIII-тубулин, фосфо-PLCγ1 и фосфо-ERK1 / 2 ^MAPK увеличиваются на 1.В 8, 2 и 1,5 раза соответственно. Данные согласуются с дифференцировкой mNS-клеток в результате стимуляции TrkB и активации нижестоящих путей. Вместе искусственные клетки управляли дифференцировкой нервных стволовых клеток в зрелые нейроны в ответ на сигнал окружающей среды.

Искусственные клетки связываются с сконструированными клетками HEK293T

Функциональность искусственных клеток была дополнительно подтверждена с клеточной линией HEK293T, которая была сконструирована для экспрессии GFP в ответ на BDNF (рис.3А). Клеточная линия сверхэкспрессирует рецептор BDNF TrkB и была разработана для ответа на повышенные уровни фосфорилированного CREB [связывающий элемент циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) связывающий элемент] (рис. S5). Активация CREB путем фосфорилирования ожидалась посредством передачи сигналов TrkB-BDNF, что приводило к активации транскрипции генов под контролем промотора CRE, в данном случае GFP ( 24 ). Другими словами, экспрессия GFP будет обнаружена только в том случае, если искусственные клетки синтезируют и высвобождают BDNF в ответ на 3OC6 HSL.Из-за поликлональной природы конечной клеточной линии при индукции ожидались различные уровни экспрессии GFP ( 25 ). Чтобы лучше оценить изменения экспрессии GFP, клетки HEK293T анализировали на уровне популяции. По сравнению с отрицательным контролем, где искусственные клетки продуцировали и секретировали инертный белок, при добавлении химического триггера 3OC6 HSL было обнаружено 45 ± 4% увеличение количества клеток HEK293T, экспрессирующих GFP (рис. 3, B и C). . Напротив, инкубация с искусственными клетками, не экспрессирующими белковые поры, приводила только к увеличению популяции флуоресцентных клеток на 10-7% (рис.3С). Вместе искусственные клетки были способны вызывать желаемые фенотипические изменения в эукариотических клетках посредством контролируемого высвобождения BDNF.

Рис. 3 Искусственные клетки влияют на поведение клеток HEK293T.

( A ) Обзор искусственной обработки клеток HEK293T. Слева: Обзор передачи сигналов между искусственными клетками и нервными стволовыми клетками. Искусственные клетки активируют экспрессию генов за промотором, регулируемым CRE, которым был GFP. Справа: мультфильм, изображающий лечение, и поперечный разрез лунки с культурой клеток.( B ) Типичные микроскопические изображения экспрессии GFP в генно-инженерных клетках HEK293T. Как показано на рис. 2, биологически неактивные искусственные клетки считались имитацией обработки и использовались для нормализации для оценки изменения сигнала (обозначенного как «Фон»). Масштабные линейки, 50 мкм. ( C ) Статистический анализ GFP-экспрессирующих клеток HEK293T, обработанных искусственными клетками. Изменение количества клеток, экспрессирующих GFP, рассчитывали с использованием фоновых уровней как 0%. Процентное различие рассчитывали как изменение количества клеток GFP ⁺ на душу населения по всей популяции по отношению к фону.Данные показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего для n = 3 биологических повтора, независимые эксперименты. Статистическим тестом был критерий Стьюдента t (непарный, двусторонний).

Составные части искусственных клеток функционируют

Чтобы гарантировать, что составные части искусственных клеток функционируют в физиологических условиях, как задумано, мы стремились подтвердить экспрессию белка в везикулах. Внутрипузырное образование генетически кодируемой суперпапки GFP (sfGFP; рис.S6, от A до C) и химеру BDNF-sfGFP (рис. 4, A и B) оценивали с помощью флуоресцентной визуализации и проточной цитометрии. Через 5 часов 19 ± 3% искусственных клеток продуцировали определяемые уровни BDNF-sfGFP (фиг. 4B). Сравнение со стандартной кривой показало устойчивое выражение с внутрипузырной концентрацией ок. 65 нг / мл (рис. S6, D и E). Тот факт, что примерно одна из пяти искусственных клеток была активна в физиологических условиях, подтвердил функциональность нашей системы, особенно с учетом сложности инкапсулирования большого количества компонентов, необходимых для бесклеточной трансляции.

Рис. 4 Характеристика искусственных клеток и бесклеточного синтезированного BDNF в физиологических условиях.

( A ) Репрезентативные микроскопические изображения искусственных клеток, которые синтезируют слитый белок BDNF-sfGFP при t = 5 часов. Стрелки указывают искусственные клетки. Шкала 10 мкм. ( B ) Типичная проточная цитометрия искусственных клеток, продуцирующих BDNF-sfGFP. ( C ) Высвобождение GFP из искусственных клеток. Рекомбинантный ПФО, обозначаемый как «чистый ПФО», был получен в конечной концентрации 4 мкМ (0.2 мкг / мкл). Данные показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего для независимых экспериментов, n = 4 биологических повтора. Статистическим тестом был тест Стьюдента t (парный, двусторонний). ( D ) Экспериментальный обзор стратегии визуализации одного аксона в реальном времени для органокультуры глаза Xenopus laevis ex vivo. ( E ) Увеличение скорости аксонов наблюдалось при введении внеклеточного экспрессированного BDNF. ( F ) Репрезентативные изображения аксонов RGC из изображений в реальном времени. Шкала 10 мкм.Данные показывают медианное значение с интерквартилем для n = 4 независимых биологических повтора. Статистический тест представлял собой двусторонний критерий Манна-Уитни, где данные не были нормально распределены (критерий Шапиро-Уилка). В каждой группе было подсчитано не менее 55 конусов роста.

Далее мы попытались охарактеризовать формирование функциональных пор внутри искусственных клеток. Во-первых, внеклеточная экспрессия функциональных пор PFO была подтверждена путем количественной оценки высвобождения флуорофора с помощью спектрофлуорометрии, проточной цитометрии и эксклюзионной хроматографии (фиг.S7 и S8). Совместное инкапсулирование бесклеточной экспрессионной системы с очищенным GFP привело к регулируемому высвобождению флуоресцентного белка из искусственных клеток, подтверждая, что внеклеточный экспрессированный PFO может высвобождать глобулярные белки (фиг. 4C и фиг. S8). Через 16 часов в присутствии 3OC6 HSL наблюдали почти трехкратное увеличение выхода GFP из искусственных клеток по сравнению с искусственными клетками в отсутствие 3OC6 HSL (фиг. 4C и фиг. S8D). Фракция искусственных клеток, способная синтезировать белок (рис.4B и рис. S6) соответствовала фракции искусственных клеток, которые высвобождали груз за счет активности экспрессированного PFO (фиг. 4C и фиг. S8D). Титрование с рекомбинантно экспрессированным и очищенным PFO соответствовало образованию функциональных пор с содержанием белка менее 30 нМ (рис. S8E).

Искусственные клетки стабильны в физиологических условиях

Высвобождение BDNF произошло из-за активности PFO, а не из-за деградации искусственных клеток. Целостность искусственных клеток не была нарушена через 24 часа при 30 ° или 37 ° C, о чем судили по утечке инкапсулированного декстрана и пиранина (фиг.S9 и S10). Искусственные клетки могут выдерживать культуральную среду с низкой осмоляльностью, то есть L-15 (рис. S9), среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM) (рис. S9 и S10), и DMEM с добавлением 10% (об. / Об.) Эмбриональной коровы. сыворотка (FBS) (рис. S11). Тем не менее, в качестве меры предосторожности старые искусственные клетки удаляли и заменяли свежими искусственными каждые 24 часа (рис. 2А). Через 1 неделю 85% искусственных клеток выжили при совпадении с клетками HEK293T в условиях отсутствия сыворотки (рис.S12). Бесклеточная трансляция внутри искусственных клеток обычно прекращается через 5 часов ( 26 ) и, вероятно, останавливается раньше при экспрессии PFO из-за утечки субстратов, необходимых для синтеза белка. Однако экстракт S12, поддерживающий синтез мРНК и белка, был долговечным, сохраняя 50% активности после 6 часов покоя при 37 ° C (рис. S13). Данные о стабильности (рис. S9 — S13) и данные, демонстрирующие, что поры PFO способны высвобождать захваченные макромолекулы (рис.S8, D и E) соответствовали искусственным клеткам, которые высвобождали BDNF при индукции 3OC6 HSL, а не из-за разложения мембраны. Кроме того, искусственные клетки не были токсичными для клеток HEK293T. Никакой токсичности не наблюдалось при анализе с 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромидом (МТТ) после совмещения в течение 24 часов и 1 недели (рис. S14). Данные о токсичности клеток HEK293T (рис. S14A) и данные о функциональности искусственных клеток (рис. S8E) вместе показали, что искусственные клетки производили и / или пропускали ПФО в наномолярном диапазоне.Хотя потребуется дополнительная работа, чтобы превратить такие искусственные клетки в технологию, которую можно было бы использовать в клинических испытаниях, нынешний состав является надежным и функциональным в физиологических условиях. Мы также отмечаем, что липосомальная доставка молекул лекарства в настоящее время существует ( 27 ), а включение ПЭГилированных липидов увеличивает время циркуляции ( 28 ). Описанные здесь искусственные клетки содержат 1 мол.% ПЭГилированного липида.

Внеклеточный экспрессированный BDNF активен

Активность обусловлена ​​синтезом и высвобождением BDNF, а не другими компонентами искусственной клетки.Внеклеточный экспрессированный BDNF вызывал аналогичные фенотипические изменения, наблюдаемые с BDNF-секретирующими искусственными клетками, и дополнительно проявлял активность ex vivo с органокультурами, полученными из эмбрионов (фиг. 4, D-F; фиг. S15; и фильмы S1 и S2). Например, как коммерческий, так и внеклеточный экспрессируемый BDNF запускал сигнальный путь TrkB и индуцировал экспрессию GFP в сконструированных клетках HEK293T (фиг. S5E и S15, от A до C). Параллельно с увеличением экспрессии GFP, повышенные уровни сигнального белка ERK1 / 2 ^MAPK были обнаружены при индукции с помощью BDNF (фиг.S5C и S15C). Бесклеточный экспрессированный BDNF также способствует дифференцировке и выживанию нейронов in vitro с клетками mNS. Через 13 дней in vitro бесклеточные клетки mNS, обработанные BDNF, более интенсивно дифференцировались в нейроны по сравнению с отрицательным контролем, который состоял из бесклеточной реакционной смеси без матрицы ДНК, кодирующей BDNF (рис. S15, E и F ). Кроме того, внеклеточный экспрессированный BDNF защищал от апоптоза, как было определено путем подсчета клеток иммуноокрашенных клеток для расщепленной формы каспазы-3 (рис.S15, E и G). Наконец, способность бесклеточного экспрессированного BDNF стимулировать дифференцировку нейронов ex vivo оценивали путем оценки острой активности BDNF в отношении удлинения аксонов. Используя стратегию визуализации одного аксона в реальном времени (фиг. 4D), нанесение в ванну бесклеточного экспрессированного BDNF вызывало 40% увеличение скорости роста в течение 35-минутного воздействия (фиг. 4, E и F). Из-за высокой чувствительности аксонов ex vivo к концентрации BDNF было невозможно с нынешним составом искусственных клеток провести значимый аналогичный эксперимент.Тем не менее, для всех трех модельных систем данные, собранные с бесклеточным экспрессированным BDNF, были сопоставимы с данными коммерческого BDNF (фиг. 4E и фиг. S15).

Оптимизированная реакция E. coli S12 была способна производить биологически релевантные количества BDNF. Концентрации in vitro бесклеточного экспрессированного BDNF определяли количественным методом иммуноблоттинга. При общих бесклеточных экспрессированных концентрациях BDNF, составляющих 100 ± 20 мкг / мл, было обнаружено, что по крайней мере от 5 до 10% общего растворимого белка (10 ± 2 мкг / мл) находится в активном димерном состоянии (рис.S16F). Инкапсуляция привела к 3,5-кратному снижению количества синтезированного белка по сравнению с периодическими реакциями (рис. S13C). После сборки искусственных клеток, по оценкам, только 10% первоначально инкапсулированной бесклеточной реакции было сохранено, что соответствовало объему 1 мкл. Внутренний объем всех искусственных клеток, сложенных вместе, составлял приблизительно ¹ / ₅₀₀ от объема питательной среды с учетом потерь, связанных с манипуляциями.Поскольку 20% синтезированного белка было высвобождено из искусственных клеток (рис. 4C), конечная концентрация BDNF была в 2500 раз ниже. Однако используемый протокол дифференцировки увеличил количество свежих искусственных клеток, добавляемых каждые 3 дня, на 50%. Таким образом, концентрация высвобожденного BDNF была консервативно оценена как 50 ± 10 нг / мл в течение всего протокола дифференцировки мНС-клеток. Это значение согласуется с sfGFP, продуцируемым внутри пузырьков (ок.65 нг / мл; инжир. S6), более ранние отчеты других авторов о синтезе белка в везикулах ( 29 ) и ранее оптимизированные протоколы дифференцировки ( 22 ). Следовательно, физиологически релевантные концентрации BDNF могут быть продуцированы и высвобождены из искусственных клеток, чтобы вызвать ответ эукариотических клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы и реагенты

Все химические вещества были закуплены у Sigma-Aldrich (Merck) с максимально возможной чистотой, если не указано иное.Коммерческий BDNF был рекомбинантно экспрессирован в E. coli и приобретен у PeproTech. Липиды были от Avanti Polar Lipids. E. coli Rosetta2 (DE3) использовали для приготовления экстракта S12. E. coli NEB5α (New England Biolabs) использовали для общего молекулярного клонирования. E. coli BL21 (DE3) (New England Biolabs) использовали для экспрессии рекомбинантного белка.

Генетические конструкции и рекомбинантные белки

Все клонирование проводилось с помощью Gibson Assembly ( 47 ), если не указано иное.Для всех конструкций, использованных с искусственными клетками, pSB1A3 из реестра iGEM (parts.igem.org) была основой вектора. Последовательности промотора, терминатора и короткого тега (<50 пар оснований) были взяты из реестра iGEM (BBa_R0040, BBa_J23101, BBa_J23106, BBa_J23117, BBa_R0062 и BBa_B0010). Оптимизированная по кодонам последовательность E.coli зрелого мышиного BDNF была синтезирована с помощью GenScript. Комплементарная ДНК (кДНК) TrkB человека была синтезирована GenScript в двух частях, соединена внутри компании Gibson Assembly и клонирована в вектор pLenti с помощью стандартных методов молекулярного клонирования.Ген LuxR был взят из плазмиды реестра BBa_T9002. Ген PFO был из ранее опубликованной конструкции ( 48 ). Плазмида экспрессии CRE-регулируемого гена была взята из предыдущего сообщения ( 25 ). Используемые генетические конструкции и плазмиды, использованные в этом исследовании, представлены в таблице S2. Рекомбинантные белки экспрессировали и очищали, как описано ранее ( 49 ). N-концевой 6xHis-тег использовали с гибкой линкерной последовательностью (GGGS) _1-2 .

Приготовление экстракта

E. coli S12

Домашний экстракт E. coli S12 получали с использованием опубликованных протоколов в качестве руководства ( 20 ). Rosetta2 (DE3) наносили штрихами на чашки с агаром 2xYT + P, содержащие хлорамфеникол (34 мкг / мл), и инкубировали в течение ночи при 37 ° C. Отдельную большую колонию отбирали для выращивания в течение ночи (точно 15 часов), чтобы приготовить исходные смеси для замораживания (10-кратные концентрации) в 2xYT + P, содержащие 12,5% глицерина, 100 мМ MgSO ₄ и 25 мМ трис-Cl (pH 8.0). Для приготовления экстракта E. coli S12 новую культуру в течение ночи (15 часов) готовили из исходного материала морозильной камеры в 2xYT + P с хлорамфениколом (34 мкг / мл). На следующий день культуру переносили в 1-литровую предварительно нагретую 2xYT + P в 5-литровых колбах с разведением 1: 100 и инкубировали при встряхивании (220 об / мин) при 37 ° C без перемешивания в течение от 3 до 3,5 часов. Затем клетки немедленно собирали и центрифугировали в течение 10 мин при 6000 g , 4 ° C. С этого момента клетки постоянно поддерживали при 4 ° C, и все центрифугирования проводились в идентичных условиях.Бактериальные осадки на короткое время промывали, ресуспендировали в предварительно охлажденном буфере S12A [14 мМ Mg ²⁺ глутамата, 60 мМ K ⁺ глутамата, 2 мМ дитиотреитола (DTT), 50 мМ трис-Cl (pH 7,7) с добавлением концентрированной уксусной кислоты. acid], снова центрифугировали в тех же условиях и ресуспендировали в ¹ / ₁₀ части исходного объема буфера S12A для переноса клеток в предварительно охлажденные 50-мл пробирки Falcon. После второго цикла промывки остаточный буфер удаляли и определяли вес влажного осадка.Затем к осадку клеток добавляли автоклавированные стеклянные шарики (5-кратный общий вес, диаметр 100 мкм) и буфер S12A (0,9-кратный общий вес) с встряхиванием после каждого добавления. Затем пробирки Falcon разрезали пополам и смесь суспензии с шариками осторожно переносили в пробирки для взбивания шариков, используя шприцы объемом 1 мл без иглы. Применяли осторожность, чтобы избежать появления видимых пузырьков внутри пробирок, и полученную смесь хранили в течение ночи при -80 ° C. После оттаивания смеси суспензии и шариков на льду в течение <2 часов взбивание шариков выполняли с частотой 6 ударов.5 м / с в течение 30 с (× 2) (FastPrep-24, MP Biomedicals). Затем неочищенный клеточный экстракт отделяли от стеклянных шариков центрифугированием на колонках Bio-Rad Bio-Spin. Экстракт клеток переносили в новые пробирки для удаления клеточного дебриса, для чего требовалось как минимум два центрифугирования. Неочищенный клеточный экстракт инкубировали при 37 ° C при встряхивании (220 об / мин) в течение 80–90 мин в пробирках с открытыми крышками и затем осветляли не менее двух раз центрифугированием. Наконец, экстракт диализовали против свежеприготовленного буфера S12B (14 мМ Mg ²⁺ глутамата, 60 мМ K ⁺ глутамата, 1 мМ DTT, доведенный до pH 8.2 с 2 М трис-базой). Первый курс диализа длился <3 часов. Второй раунд диализа проводили в течение ночи (<24 часов) при 4 ° C. Для диализа использовали диализную трубку MWCO SnakeSkin 10 кДа (Thermo Fisher Scientific) при осторожном перемешивании. После диализа экстракт разделяли на аликвоты, хранили при -80 ° C и использовали в течение 1 года с даты приготовления.

Транскрипция-трансляция in vitro

Реакции транскрипции-трансляции in vitro и искусственные клетки проводили при 30 ° C в конечном объеме от 10 до 50 мкл.Реакции in vitro проводились либо в приборе для количественной ПЦР Rotor-Gene Q (Qiagen), либо в планшет-ридере без встряхивания (Tecan Infinite M200). Реакции искусственных клеток были в инкубаторе. Для экспериментов с планшет-ридером каждую лунку в 96-луночном планшете с черным / прозрачным дном (Costar 3603) покрывали 50 мкл стерильного минерального масла, чтобы избежать испарения. Для реакций E. coli S12 в физиологических условиях конечный состав раствора аминокислот составлял 0,5 мМ каждая. Энергетический раствор представлял собой 20 мМ 3-фосфоглицериновую кислоту, 1 мМ аденозинтрифосфат (АТФ), 1 мМ гуанозинтрифосфат (GTP), 0.6 мМ цитидинтрифосфат (CTP), 0,6 мМ уридинтрифосфат (UTP), транспортная РНК (тРНК) (0,133 мг / мл), 0,17 мМ кофермент A, 0,22 мМ никотинамидадениндинуклеотид (NAD ⁺ ), 0,5 мМ цАМФ, 0,045 мМ фолиновая кислота, 0,66 мМ спермидин и 33 мМ Na ⁺ Hepes (pH 8,0). Раствор добавки представлял собой 2% (мас. / Об.) Полиэтиленгликоль 4000 (PEG 4000), 10 мМ глутамата Mg ²⁺ , 10 мМ глутамата K ⁺ , 20 мМ сахарозы и 6 мМ мальтозы. В таблице S1 приведены конечные концентрации оптимизированной системы.Для сравнения между периодическим режимом и экспрессией эмульсии вода-в-масле реакции были либо инкапсулированы внутри эмульсий после инкубации in vitro, либо непосредственно инициированы внутри эмульсии. Растворенные в минеральном масле липиды для эмульсий вода-в-масле были приготовлены, как описано в следующем разделе, и содержали POPC с добавлением 1% (об. / Об.) Сорбитанмоноолеата (Span 80). Плазмидную ДНК получали с использованием наборов Qiagen Plasmid Midi (12145) и ресуспендировали в деионизированной воде, свободной от нуклеаз.ДНК количественно определяли с помощью NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific), разбавляли, разделяли на аликвоты, хранили при -20 ° C в концентрации 200 нМ и использовали в конечной концентрации от 10 до 40 нМ. Компоненты реакции собирали в следующем порядке с коротким встряхиванием после каждого добавления и без центрифугирования: экстракт E. coli S12, раствор аминокислоты, энергетический раствор, ПЭГ, раствор добавки, вода и плазмидная ДНК.

Создание искусственных клеток

Везикулы и искусственные клетки были созданы с использованием ранее опубликованной методологии преобразования эмульсии вода-в-масле в везикулы с небольшими изменениями (рис.S3) ( 50 ). Как правило, использовали растворы равной осмоляльности для наружных (либо аланин, либо PBS Дульбекко (DPBS)) и внутренних ( E. coli, реакция S12 или сахароза) растворов везикул. Осмоляльность определяли по понижению температуры замерзания 25 мкл образцов с помощью осмометра от Löser. Везикулы получали из POPC и холестерина (Sigma-Aldrich) с общей конечной концентрацией 380 мкМ, либо с 1 мол.% 1,2-дистеароил- sn -глицеро-3-фосфоэтаноламина- N — [биотинил], либо без него. (полиэтиленгликоль) -2000] (соль аммония) [DSPE-PEG (2000) Biotin, Avanti Polar Lipids].Везикулы готовили в стерилизованных стеклянных флаконах с использованием стерильного минерального масла для клеточных культур (BioXtra 5310, Sigma-Aldrich) и защищали от света путем обертывания алюминиевой фольгой или с помощью пузырьков из янтаря. Вкратце, исходные липидные смеси хлороформа переносили пипеткой в ​​стеклянные флаконы и осторожно сушили при постоянном потоке N ₂ . Полученную сухую липидную пленку помещали под вакуум более чем на 4 часа для удаления остаточного растворителя. Высушенный липид растворяли в минеральном масле, встряхивали и кратко инкубировали при 80 ° C в печи несколько раз до тех пор, пока нерастворенный материал больше не был виден.Растворенные липиды обрабатывали ультразвуком на водяной бане (от 50 ° до 60 ° C) в течение 30-60 минут, в зависимости от размера пузырька и толщины стекла. Затем липиды хранили в темноте и использовали в течение 1 недели после приготовления. Полученный липидный раствор осторожно наносили на внешний раствор в пробирке Эппендорфа. Смесь оставляли в покое на 30-60 минут, чтобы обеспечить разделение фаз и образование монослоя (рис. S3). Затем 10 мкл свежесобранной реакционной смеси E. coli S12 пипеткой вносили в 500 мкл липидного раствора минерального масла в отдельной пробирке для получения эмульсии вода-в-масле путем перемешивания путем быстрого протягивания пробирки над штативом.Эмульсию оставляли для уравновешивания при комнатной температуре в течение прибл. 1 мин и наложили на интерфейс, а затем от 2 до 3 мин инкубации. Искусственные клетки формировали и осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин. Верхний слой минерального масла удаляли вакуумом до прибл. Осталось 50 мкл водного раствора. Осадок искусственных клеток промывали не менее двух раз (по 1 мл каждый) либо аланином, либо DPBS без Mg ²⁺ и Ca ²⁺ (для экспериментов с культурами клеток) и с центрифугированием при 5000 g в течение 1 мин.После этой обработки каждый образец искусственных клеток объемом 1,5 мл содержал не более 0,5–1 мкл инкапсулированной бесклеточной реакции.

Анализ высвобождения кальцеина и функциональность пор PFO

Приготовление везикул осуществлялось в соответствии с ранее опубликованными протоколами ( 51 , 52 ). Инкапсулирующие не-S12 («пустые») везикулы с различным содержанием холестерина получали путем гидратации тонкой липидной пленки водой Milli-Q до 100 мкл. Общая концентрация липидов составляла 23 мМ (POPC + холестерин).Смесь гидратированных липидов подвергали пяти циклам замораживания / оттаивания. Пустые везикулы гомогенизировали с помощью ручного гомогенизатора (IKA T10 Basic) и экструдировали до 100 нм с помощью мини-экструдера Avanti Polar Lipids. Затем везикулы лиофилизировали в течение ночи с помощью Rotavap R-210 (Büchi) или концентратора ДНК CentriVap (Labconco) и хранили при -20 ° C. Лиофилизированные исходные растворы использовали в течение 1 года после приготовления. Для проверки эффективности порообразования с помощью PFO везикулы регидратировали с помощью 80 мМ кальцеина и очищали от неинкапсулированного флуорофора с помощью эксклюзионной хроматографии со смолой сефарозы 4b.Десять микролитров реакции транскрипции-трансляции in vitro были собраны, как описано выше (см. Раздел «Транскрипция-трансляция in vitro»), со свежеочищенными кальцеин-содержащими везикулами, имеющими по меньшей мере ¹ / ₁₀ часть конечного реакционного объема ( 1 мкл). Реакцию инкубировали при 30 ° C, и флуоресценцию (λ _ex = 485 нм; λ _em = 515 нм) отслеживали с течением времени с помощью прибора RotorGene Q. Для испытаний активности PFO, экспрессируемой в искусственных клетках, плазмидную ДНК, кодирующую LuxR-PFO (DT034A), инкапсулировали в концентрации 20 нМ.Экспрессию PFO индуцировали после 30-60 мин инкубации при 30 ° C с 10 мкМ 3OC6 HSL из 1 мМ исходного раствора в 10% (об. / Об.) Диметилсульфоксиде (ДМСО). Реакцию останавливали через 16 часов после индукции. Затем искусственные клетки обрабатывали и анализировали, как описано в следующем разделе.

Проточная цитометрия

Искусственные клетки перед анализом разбавляли 300 мМ аланином или PBS. Проточная цитометрия проводилась с помощью FACSCanto A (BD Biosciences) с настройкой скорости потока «низкий» и значениями напряжения 350 В (для SSC-W), 400 В [SSC-A, FSC-A и FITC (флуоресцеинизотиоцианат). для Alexa Fluor 488 – декстран и пиранин (8-гидроксипирен-1,3,6-трисульфоновая кислота)] или 700 В (FITC для GFP и sfGFP).Для каждого прогона было зарегистрировано не менее 10 000 стробированных событий или 50 000 полных событий с использованием стратегии стробирования, которая учитывала только фракции, содержащие гигантские везикулы (рис. S3D) ( 53 , 54 ). Проточный цитометр был откалиброван с использованием частиц размером 1 и 10 мкм для оптимизации напряжения и определения размера частиц. Одиночные и двойные события различались по графикам SSC-A и SSC-W, и только одиночные события были приняты во внимание для статистического анализа (рис. S8B). Для экспериментальной стратегии гейтирования образцы «Без ДНК» и / или «Без декстрана / GFP» использовали в качестве отрицательного контроля для определения FITC-положительных событий для создания нового гейта.При статистическом анализе учитывались как потеря интенсивности FITC (из-за выхода GFP через поры PFO), так и процентные изменения событий конкретных ворот. Данные анализировали с помощью программного обеспечения FACSDiva (BD Biosciences) или FlowJo v10 (FlowJo LLC). Все события были нанесены псевдоцветом.

Микроскопия

Искусственные клетки визуализировали с помощью микроскопа Axio Zeiss Observer Z1, оснащенного либо 100-кратным (Plan-Apochromat 100x / 1.4 oil DIC), либо 40-кратным (EC Plan Neofluar 40 × / 0.75) цель. Эмульсии вода-в-масле получали с помощью объектива 20X (LD Plan Neofluar 20 × / 0,4 Korr Ph3 M27). Для обоих значений возбуждения и испускания были λ _ex = 484 ± 25 нм и λ _em = 525 ± 50 нм. Искусственные изображения клеток были получены с использованием физической прокладки между покровным стеклом и предметными стеклами, обработанными Repel Silane (GE Healthcare). Для HEK293T и / или стволовых клеток визуализацию выполняли либо с помощью Axio Zeiss Observer Z1 (объективы: 10 × EC, повышенный контраст; 20 × LD, большое расстояние), либо конфокального микроскопа с вращающимся диском Nikon Eclipse Ti2.Клетки HEK293T культивировали в 15-миллиметровых стеклянных покровных стеклах, предварительно обработанных поли-L-лизином (100 мкг / мл) (Sigma-Aldrich), и отображали их на предметных стеклах, приготовленных с использованием самодельной монтажной среды по следующему рецепту: 4 мМ Mowiol (молекулярная масса: 31000; Sigma-Aldrich), 25% глицерина (об. / Об.), 0,3% (мас. / Об.) Азида натрия и 50 мМ трис-Cl (pH 8,0). Для беспристрастного сбора данных все изображения были сделаны либо с помощью автоматизированного столика (Nikon Eclipse Ti2), либо случайного поля культуры, сфокусированного / определяемого только ядрами (Observer Z1).Для анализа коллапса Xenopus изображения растущих аксонов были получены в светлом поле с помощью микроскопа Axio Zeiss Observer, оснащенного объективом 40x. Для анализа коллапса покровные стекла закрепляли с помощью ImmunoHistoMount (Sigma-Aldrich) на предметном стекле и наблюдали с помощью микроскопа Leica DMi8, оснащенного объективом HCX PL Fluotar L 40 × / 0,6 Leica DMi8.

Культура клеток HEK293T

Клетки HEK293T дикого типа были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС), культивированные в среде с высоким содержанием глюкозы (4.5 г / литр) полной DMEM (Corning) с 10% (об. / Об.) FBS (Gibco), пенициллин / стрептомицин (100 мкг / мл) (Corning) и 2 мМ l-глутамина (Corning) при 37 ° C с 5% CO ₂ . Производство лентивируса осуществлялось по ранее установленным протоколам ( 55 ). Вкратце, вирусы были продуцированы в HEK293T дикого типа с лентивирусной системой второго поколения и трансфицированы pLenti – цитомегаловирус (CMV) –TrkB и вспомогательными вирусными упаковывающими плазмидами с использованием липофектамина 2000 (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя.После трансфекции среду меняли после инкубации в течение ночи при 37 ° C. Впоследствии, через 24, 48 и 72 часа среды объединяли и концентрировали с использованием 50% (мас. / Об.) PEG 4000. Для создания стабильной линии клеток CMV-TrkB клетки HEK293T дикого типа высевали в клетку. плотность 2 × 10 ⁶ в 10-сантиметровых чашках и преобразована при 70% конфлюэнтности. На 3-й день клетки заражали пуромицином (1 мкг / мл) и поддерживали в культуре до тех пор, пока не наблюдались отдельные прозрачные колонии (рис.S5A). Отдельные колонии выделяли, собирали и переносили в новые шестилуночные планшеты для размножения, при этом отбор сохраняли до тех пор, пока уровни экспрессии не были подтверждены иммунофлуоресценцией против общего белка TrkB (фиг. S5B). Для линии клеток CMV-TrkB-CRE-GFP клетки трансфицировали плазмидной ДНК, содержащей Т-антиген SV40, с использованием полиэтиленимина (PEI; 1 мг / мл, Sigma-Aldrich) с плазмидным остовом, линеаризованным с помощью ScaI. На 2 день клетки заражали зеоцином (400 мкг / мл) (Thermo Fisher Scientific) и поддерживали в культуре до появления прозрачных одиночных колоний (рис.S5D). Полученную стабильную поликлональную клеточную линию использовали во всех последующих экспериментах, если не указано иное. Из-за поликлональной природы конечной клеточной линии ожидались различные уровни экспрессии GFP при индукции, как сообщалось ранее ( 25 ). Клетки были подтверждены как отрицательные по микоплазме.

Функциональность бесклеточного экспрессированного BDNF с HEK293T

Для вестерн-блоттинга клетки HEK293T-CMV-TrkB высевали в 12-луночные планшеты с плотностью 2 × 10 ⁵ на лунку и культивировали при 37 ° C до достижения 70% конфлюэнтность.В день обработки клетки промывали один раз теплым DPBS без Mg ²⁺ и Ca ²⁺ (Gibco), а затем оставляли без сыворотки в течение 4 часов с полной DMEM без сыворотки. Бесклеточный BDNF сначала разбавляли 1: 3 DPBS без Mg ²⁺ и Ca ²⁺ , а затем разбавляли дополнительно до 1: 1000. Клетки инкубировали от 2 до 30 мин при 37 ° C; лизировали буфером, содержащим 50 мМ Hepes (pH 8,0), 2% (об. / об.) SDS и 50 мМ DTT; и помещают на лед или хранят при -20 ° C до использования для иммуноблоттинга.Для флуоресцентной визуализации за день до лечения клетки HEK293T-CMV-TrkB-CRE-GFP высевали в обработанные поли-l-лизином (37 ° C в течение 1 часа с [конечной] = 0,1 мг / мл) 24-луночные планшеты. с плотностью 2 × 10 ⁵ на лунку. В день обработки клетки один раз промывали полной средой DMEM без FBS (1 мл) и инкубировали при 37 ° C в течение прибл. 7 часов до обработки (конечный объем 500 мкл). Бесклеточный синтез BDNF описан в разделе «Транскрипция-трансляция in vitro».После 7-12 часов бесклеточной экспрессии при 30 ° C раствор, содержащий BDNF, разводили в 1000 или 500 раз (от 4-кратного предварительного разведения) PBS перед добавлением к клеткам HEK293T. Впоследствии с клетками обращались, как описано в разделе «Иммунофлуоресценция» (без блокирования или добавления антител).

Связь между искусственными клетками и клетками HEK293T

Эукариотические клетки получали, как описано в предыдущем разделе для флуоресцентной визуализации. Единственным исключением является то, что клетки высевали на 24-луночные планшеты, обработанные поли-l-лизином (0.1 мг / мл, Sigma-Aldrich). Искусственные клетки той же экспериментальной группы были приготовлены в четырех идентичных пробирках объемом 1,5 мл, сконцентрированы в отдельные флаконы, инкубированы при 30 ° C в течение 5 часов и добавлены поверх эукариотических клеток (без Transwell). Образцы искусственных клеток и эукариотических клеток совпадали при 37 ° C в течение дополнительных 16 часов. Впоследствии клетки HEK293T дважды промывали 500 мкл PBS для удаления искусственных клеток. С этого момента с эукариотическими клетками обращались, как описано в разделах «Иммунофлуоресценция» (без блокирования или добавления антител) и «Микроскопия».

Культура нервных стволовых клеток

Нервные стволовые клетки мыши (mNS) получали из эмбриональных стволовых клеток мыши, как описано ранее ( 22 ). Клетки mNS обычно пассировали каждые 3-4 дня в соотношении от 1: 3 до 1: 5 в среде самообновления mNS, состоящей из Euromed-N (Euroclone) с добавкой N2 [1% (об. / об.), Thermo Fisher Scientific], EGF (эпидермальный фактор роста) и bFGF (основной фактор роста фибробластов) (оба 20 нг / мл, PeproTech) и GlutaMAX (2 мМ, Thermo Fisher Scientific).Для пассирования клетки mNS инкубировали с StemPro Accutase (Thermo Fisher Scientific) и центрифугировали при 260 g в течение 3 минут. Осадок ресуспендировали в свежей среде и высевали на пластиковые сосуды, обработанные культурой.

Для дифференцировки нейронов мНС-клетки подвергали условиям, описанным в литературе ( 23 ). Вкратце, 1 × 10 ⁵ клеток / см ² высевали в обработанные культурой пластиковые сосуды в среде D1, состоящей из среды Euromed-N (Euroclone) с добавкой N2 [1% (об. / Об.), Thermo Fisher Scientific ], Приложение B27 [0.5% (об. / Об.) Thermo Fisher Scientific], bFGF (10 нг / мл, PeproTech) и GlutaMAX (2 мМ, Thermo Fisher Scientific) и культивировали в течение 72 часов (от 0 до 3 дней in vitro). В этот период BDNF не добавлялся. Затем клетки осторожно отделяли, как описано выше, и повторно высевали на покрытые ламинином (3 мкг / мл, Thermo Fisher Scientific) пластиковые 24-луночные планшеты с плотностью 3,5 × 10 ⁴ клеток / см ² в среде D2 [1: 3 смесь DMEM / F-12 и нейробазальной среды, 0,5% (об. / Об.) N2, 1% (об. / Об.) B27, bFGF (10 нг / мл)] в течение 96 часов (от 4 до 6 дней in vitro).На следующий день после повторного посева (на 4-й день) были начаты либо коммерческие BDNF, искусственные клетки, либо бесклеточная реакционная обработка. Для окончательного созревания нейронов (от 7 до 16 дней in vitro) среду заменяли на среду D3 [смесь DMEM / F-12 и нейробазальной среды в соотношении 1: 3, 0,5% (об. / Об.) N2, 1% (об. / Об.) ) B27 и bFGF (6,7 нг / мл)] и обновляли каждые 3 дня вместе с лечением. Клетки были подтверждены как отрицательные по микоплазме.

Функциональность бесклеточного BDNF с нервными стволовыми клетками

mNS-клетки были дифференцированы, как описано в предыдущем разделе, со следующими модификациями.С четвертого дня in vitro до конца процедуры дифференцировки проводили реакцию бесклеточного синтеза BDNF, как описано в предыдущем разделе, в течение от 7 до 12 часов при 30 ° C. Внеклеточный экспрессированный BDNF предоставлялся в возрастающих концентрациях каждые 72 часа со следующими разведениями: 1: 1000 (от 4 до 6 дней in vitro), 1: 750 (от 7 до 9 дней in vitro) и 1: 500 (от 10 до 19 дней in vitro). Коммерческий BDNF был предоставлен в конечных концентрациях 20, 30 и 40 нг / мл.

Связь между искусственными клетками и нервными стволовыми клетками

mNS-клетки были дифференцированы, как в разделе «Культура нервных стволовых клеток», до дня лечения.Начиная с первого дня лечения искусственными клетками, использовали 24-луночные планшеты Transwell (Costar 3413, вставка 6,5 мм, поликарбонатная мембрана 0,4 мкм) с проницаемыми опорами, чтобы избежать влияния прямого контакта искусственных клеток со стволом. клетки. Среду для выращивания добавляли в нижнюю камеру (500 мкл), а искусственные клетки (100 мкл) добавляли в верхнюю камеру. Искусственные клетки, продуцирующие BDNF, содержали ДНК, кодирующую BDNF (DT033A) в количестве 20 нМ, и другую плазмиду, кодирующую LuxR и PFO (DT034A), в концентрации 10 нМ.Каждые 72 часа общее количество искусственных клеток увеличивалось в концентрации в 1,5 раза. Во всех случаях использовали 10 мкМ 3OC6 HSL для индукции экспрессии PFO. Добавление 3OC6 HSL из исходного раствора никогда не приводило к конечной концентрации ДМСО в культуре выше 0,1% (об. / Об.). Каждые 24 часа 350 мкл среды заменяли свежей средой, а камеры Transwell тщательно промывали PBS перед добавлением свежих искусственных клеток. С этого момента с клетками обращались, как описано в разделах «Иммуноокрашивание» и «Микроскопия».Дифференцировка нейронов была остановлена ​​через 19 дней после микроскопического наблюдения, которое показало, что удовлетворительные уровни нейронов в культурах были достигнуты в контрольных контрольных культурах (т.е. культурах, поддерживаемых в стандартных условиях дифференцировки с коммерческим BDNF).

Поддержание

эмбрионов Xenopus laevis

Эмбрионов Xenopus laevis были получены путем оплодотворения in vitro, выращенного в 0,1 × MMR (раствор Рингера, модифицированный Марком) (pH 7.5) при температуре от 14 ° до 22 ° C и в соответствии с предшествующей литературой ( 56 ). Все эксперименты с животными были одобрены итальянским Министерством делла Салюте с разрешением № 546/2017-PR в соответствии со статьей 31 Закона США. 26/2014.

Анализ удлинения аксонов

Для Xenopus культур эксплантатов сетчатки стеклянные покровные стекла (Bellco) или чашки со стеклянным дном (MatTek) покрывали поли-L-лизином (Sigma-Aldrich, 10 мкг / мл, разведенный в воде) и ламинином (Sigma-Aldrich, 10 мкг / мл), разведенным в среде L-15 (Gibco).Целые глаза из анестезированных эмбрионов подвергали микродиссекции и культивировали при 20 ° C в среде 60% L-15 + пенициллин-стрептомицин-фунгизон [1% антибиотик-антимикотик (Thermo Fisher Scientific)]. За день до лечения проводили реакции внеклеточного синтеза BDNF, как описано в разделе «Транскрипция-трансляция in vitro», при 30 ° C в течение 7–12 часов. Бесклеточный экспрессированный BDNF и реакции отрицательного контроля (такая же бесклеточная реакция, но без ДНК, кодирующей BDNF) были получены при разведении 1: 200.Коммерческий BDNF (PeproTech) был предоставлен в конечной концентрации от 50 до 100 нг / мл. Все условия были проверены на рост в одном эксперименте и в идентичных условиях культивирования. Визуализация и анализ были выполнены, как указано в разделе «Микроскопия». Z-стек из 10-12 плоскостей 0,7 мкм регистрировался каждые 5 минут в течение 35 минут, что давало в общей сложности 8 временных точек. Среднюю скорость каждого аксона рассчитывали как среднее значение скорости, измеренной для каждой временной точки. Программное обеспечение Fiji (ImageJ) использовалось для анализа изображений, начиная с необработанного.czi файлы. Выбиралась лучшая плоскость фокуса для каждой временной точки. Расстояние, пройденное аксоном от одной временной точки до другой, отслеживали с помощью плагина Tracking-ManualTracking ImageJ.

Анализ коллапса

Анализы коллапса аксонов ганглиозных клеток сетчатки (RGC) проводили, как описано в литературе ( 57 , 58 ). Аликвоту (от 1 до 12,5 мкл) реакции смешивали с 1 × PBS до конечного объема 100 мкл и наносили на 10 мин на аксоны RGC, культивируемые в среде 400 мкл с покровными стеклами, как описано в предыдущем разделе.Перед визуализацией эксплантаты фиксировали 2% (об. / Об.) Формальдегидом (Thermo Fisher Scientific), содержащим 7,5% (мас. / Об.) Сахарозы (приготовленной в 1 × PBS), в течение 30 мин, а затем трижды промывали 1 × PBS. Аксоны были визуализированы, как описано в разделе «Микроскопия», а коллапсирующие конусы роста подсчитывались незаметно для наблюдателя. Учитывались и анализировались только отдельные аксоны, растущие индивидуально из эксплантата глаза, чтобы избежать смешанного биологического влияния, поскольку межклеточные взаимодействия могут обеспечивать трофическую поддержку аксонов.Данные были выражены в виде процентной доли схлопнувшихся конусов роста к общему количеству подсчитанных одиночных конусов роста. Конусы роста считались свернутыми, если конусы роста не имели ламеллиподий и были меньше или равны двум филоподиям (каждая меньше или равнялась 2 мкм) ( 59 ).

Стабильность и токсичность искусственных клеток

Для анализа токсичности и стабильности искусственные клетки были приготовлены, как описано в разделе «Создание искусственных клеток».Аликвоту искусственных клеток либо очищали на колонке с сефарозой 4b, как описано ранее ( 60 ), либо анализировали проточной цитометрией при разведении 1:50. Использовалась та же стратегия гейтирования, что описана в разделе «Проточная цитометрия». Для анализа токсичности клетки HEK293T, сверхэкспрессирующие TrkB, культивировали, как описано в разделе «Культура клеток HEK293T», и высевали с плотностью 5 × 10 ³ или 4 × 10 ⁴ клеток на лунку в любой из 96-луночных лунок. или 24-луночные планшеты.Токсичность оценивали с помощью теста МТТ ( 61 ). После совмещения с искусственными клетками в заданные моменты времени старую среду для выращивания аспирировали и заменяли свежей средой для выращивания, не содержащей FBS. После добавления 10 мкл МТТ на лунку в конечном объеме 200 мкл клетки инкубировали в течение 3,5 часов при 37 ° C. Затем среду для роста заменяли 200 мкл ДМСО для растворения солей формазана. Через 15 мин инкубации при встряхивании при 23 ° C оптическую плотность измеряли при 590 нм в течение 1 часа после добавления ДМСО.Triton X-100 [0,5% (об. / Об.)] И 1 мкМ рекомбинантного PFO использовали в качестве отрицательного контроля для оценки полной гибели клеток. Положительным контролем была группа без лечения. Процент жизнеспособности клеток оценивали с использованием этих двух границ.

Иммуноблоттинг

Для экспериментов с бесклеточными экстрактами реакции транскрипции-трансляции in vitro разбавляли в 2 раза самодельным буфером Лэммли и нагревали до 95 ° C в течение 10 мин. Аликвоту загружали на электрофорез в 11% SDS-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и подвергали блоттингу с использованием обычных систем влажного переноса (300 мА, 2 часа).Нитроцеллюлозные мембраны (0,45 мкм, Bio-Rad) блокировали с использованием 5% (мас. / Об.) Обезжиренного сухого молока (Bio-Rad) в трис-буферном солевом растворе с твином (TBST), содержащим 0,1% (об. / Об.) Твин 20, и инкубировали. с моноклональным первичным антителом α-FLAG (M2), продуцированным у мышей (Sigma-Aldrich, F3165) либо при 23 ° C в течение 1 часа, либо при 4 ° C в течение 16 часов с разведением 1: 5000 в 5% молоке в TBST. После инкубации с первичным антителом мембраны трижды промывали TBST и инкубировали от 30 до 60 минут при 23 ° C с поликлональными вторичными антителами α-мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), с разведением 1:80 000 в 5% молоке в TBST.Затем мембрану трижды промывали TBST и сигнал хемилюминесценции детектировали с использованием реагентов ECL Select (GE Healthcare) с помощью Bio-Rad ChemiDoc XRS + и затем обрабатывали с помощью программного обеспечения ImageLab (Bio-Rad). Для вестерн-блоттинга белков из эукариотических клеток лизаты клеток гомогенизировали с помощью нескольких пассажей через стерильную иглу 25-го размера и загружали в SDS-PAGE (от 5 до 50 мкл). Условия блоттинга и обнаружения были такими же, как указано выше, за исключением того, что мембраны из нитроцеллюлозы были заблокированы 2.5% (мас. / Об.) Бычьего сывороточного альбумина (BSA; Euroclone) или 3% молока в TBST. В экспериментах с эукариотическими клетками использовали первичные антитела в следующих разведениях: фосфо-ERK1 / 2 с разведением 1: 2000 в 2,5% BSA [Cell Signaling Technology (CST), no. 4370], общий ERK1 / 2 с разведением 1: 2000 в 2,5% молоке в TBST (CST № 9102), фосфо-PLCγ1 с разведением 1: 2000 в 2,5% BSA (CST № 2821), общий PLCγ1 с 1: 2000 разведение в 2,5% молоке / TBST (CST № 2822), ламин A / C с разведением 1: 3200 в 2,5% молоке в TBST (Santa Cruz Biotechnology), калнексин с разведением 1: 2000 в 2.5% молока в TBST (Santa Cruz Biotechnology), βIII-тубулин в разведении 1: 1000 в 2,5% молоке в TBST (Promega, G712A) и расщепленная каспаза-3 в разведении 1: 1000 в 2,5% молоке в TBST (CST, № 9661s). Вторичные антитела, конъюгированные с HRP, получали следующим образом: α-кроличья HRP, конъюгированная с разведением 1: 2000 в 2,5% BSA (Bio-Rad), и α-мышиная HRP, конъюгированная с разведением 1: 2000 в 2,5% BSA (Bio-Rad). .

Иммунофлуоресценция

Все клетки после обработки фиксировали 4% (мас. / Об.) Параформальдегидом.После 15-20-минутной инкубации при комнатной температуре клетки промывали трижды избытком DPBS (без Ca ²⁺ и Mg ²⁺ ), затем проницаемость 0,5% (об. / Об.) Triton X-100 в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре и блокировали 5% (мас. / Об.) FBS и 0,3% (об. / Об.) Triton X-100 в PBS в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем культуры инкубировали в течение ночи при 4 ° C со специфическими первичными антителами (см. Ниже), разведенными 2% FBS и 0,2% Triton X-100 в PBS. Затем клетки трижды промывали PBS и инкубировали с соответствующими вторичными антителами, описанными ниже, в течение 2 часов при комнатной температуре.Ядра контрастировали с помощью Hoechst 33258 (0,2 мг / мл) в течение 20-30 мин при комнатной температуре и трижды промывали избытком PBS перед визуализацией. Первичные антитела были представлены следующим образом: общий TrkB в разведении 1: 1000 (Santa Cruz Biotechnology, sc-377218), βIII-тубулин в разведении 1: 1000 (Promega, G712A), расщепленная каспаза-3 в разведении 1: 500 (CST № 9661s), MAP2 в разведении 1: 300 (Chemicon-Millipore, AB5622) и глиальный фибриллярный кислый белок в разведении 1: 1000 (DAKO, Z0334).Вторичные антитела были получены следующим образом: α-кролик Alexa Fluor 488, конъюгированный с разведением 1: 2000 (Thermo Fisher Scientific), и α-мышь Alexa Fluor 633, конъюгированный с разведением 1: 2000 (Thermo Fisher Scientific).

Статистика

Если не указано иное, все статистические анализы были выполнены с помощью программного обеспечения GraphPad Prism версии 7. Для экспериментов, связанных с высвобождением GFP из искусственных клеток, данные экспериментов в присутствии и в отсутствие 3OC6 HSL были получены из той же партии. пузырьков.Таким образом, в статистическом анализе использовался парный тест t вместо непарного t . Цитозоли подсчитывали вручную с помощью Fiji (ImageJ), а ядра подсчитывали либо с помощью Fiji (ImageJ), либо с помощью прибора Operetta (PerkinElmer). Число повторений, размер популяции и статистические тесты приведены в подписях к рисункам. Для анализа иммунофлуоресценции и подсчета клеток HEK293T, экспрессирующих GFP, подсчитывали по меньшей мере 3000 клеток на условие для каждого антигена.Иммуноокрашенные и экспрессирующие GFP клетки были визуализированы с идентичным временем воздействия в рамках одного эксперимента и экспортированы из необработанных файлов .czi (программное обеспечение Zeiss Zen). Обработка, корректировка гистограмм и количественная оценка были выполнены на Фиджи (ImageJ). Время экспозиции и корректировки гистограммы указаны в таблице S3. Данные были нормализованы по общему количеству клеток в каждом поле, и распределение было оценено на предмет нормальности с использованием теста Шапиро-Уилка. Статистическую значимость определяли односторонним дисперсионным анализом (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Даннета или двусторонним тестом Стьюдента t .Значение P менее 0,05 считалось статистически значимым. Все анализы по возможности проводились слепо для наблюдателя.

Благодарности: Мы благодарим Ф. Чиццолини, Г. Берлоффа, Д. Чекки и Н. Йе-Мартин за вклад в начальные этапы этой работы; M. Notarangelo и M. M. Hanczyc за комментарии к рукописи; Л. Себолла Санауджа за материально-техническую поддержку; М. Роккуццо для скриптов ImageJ; и Ф. К. Зиммель, М. Пеннуто и Г. Пикколи для E.coli Rosetta 2 (DE3) pRARE2, клеточная линия HEK293T дикого типа и вектор CRE-GFP, соответственно. Финансирование: Финансирование от Фонда Саймонса (2

FY18 и 2

FY19 для SSM), Автономная провинция Тренто (Grandi Progetti 2012, ATTEND to SSM), Фонда Армениз-Гарвард (для SSM и M.-LB), Европейской комиссии (Грант Marie Curie Career Integration, 618969, GUIDANCE-miR для M.-LB) и MIUR SIR (RBSI144NZ4 для M.-LB). Вклад авторов: Концептуализация: Ö.D.T. и S.S.M .; методология: Ö.D.T., S.S.M., L.C., and M.-L.B .; исследование, формальный анализ, проверка и визуализация: Ö.D.T., J.Z., and S.B .; ресурсы: S.S.M., L.C., M.-L.B., P.M. и M.D.S .; письменный (первоначальный вариант): Ö.D.T., S.S.M., L.C., and M.-L.B .; просмотр и редактирование: P.M., M.D.S., J.Z., and S.B .; надзор и привлечение финансирования: S.S.M., M.-L.B. и L.C. Конкурирующие интересы: Ö.D.T, S.S.M, L.C. и M.-L. Б. являются изобретателями по международной патентной заявке, поданной Университетом Тренто, связанной с этой работой. Доступность данных и материалов: Все данные, подтверждающие выводы этого исследования, содержатся в документе и дополнительных материалах. Исходные данные и материалы доступны у соответствующего автора по разумному запросу. Плазмиды, используемые в этой работе, доступны от Addgene.

Интегрированная катушка радиочастотного приема / B0-шумового массива повышает производительность МР-спектроскопической визуализации всего мозга при 7 Тл

Наша методика была разработана и реализована на 7-тонном магнитно-резонансном томографе Magnetom (Siemens Healthcare, Эрланген, США). Германия) с программным обеспечением IDEA VB17A и оснащенной градиентной системой 7 T-SC72CD, обеспечивающей максимальную силу градиента 70 мТ / м и номинальную скорость нарастания напряжения 200 мТ / м / с.

Аппаратное и программное обеспечение для регулирования переменного / постоянного тока

Мы использовали недавно разработанное интегрированное ВЧ-приемное оборудование и матрицу регулировочных катушек B0 с несколькими катушками для динамического регулирования. Массив состоит из 31-канальной катушки переменного / постоянного тока, нанесенной на плотно прилегающий 3D-печатный поликарбонатный шлем (на 3D-принтере используется Fortus 360mc, Stratasys, Реховот, Израиль) (рис. 9A). Катушка переменного / постоянного тока имела 31 канал приема ВЧ и 31 канал B ₀ -компенсатора. В 25 контурах была добавлена ​​возможность прокладки B ₀ путем создания пути постоянного тока с использованием витой пары и индуктивных дросселей для подключения постоянного тока к радиочастотной цепи.Шесть петель на нижне-задней части шлема, которые считались менее важными для шимминга B ₀ , были сохранены как петля только для приема РЧ. Шесть четырехвитковых петлевых катушек B ₀ , предназначенных только для прокладки, были помещены на лицо для нацеливания на префронтальную кору, построенную на предшествующей работе с локальной прокладочной катушкой ⁶² из других групп. Эта конструкция AC / DC была продемонстрирована при моделировании ⁹ , чтобы обеспечить сопоставимые характеристики прокладки B ₀ с пластиной прокладки со сферическими гармониками порядка 4 ^th .Таким образом, эта аппаратная установка сохраняет чувствительность приема плотно подогнанной радиочастотной приемной матрицы мозга, а также обеспечивает возможность локального управления полем B ₀ с использованием того же массива — обе эти функции имеют решающее значение для получения высококачественных данных MRSI. Для передачи РЧ сигнала использовалась самодельная регулируемая квадратурная катушка в виде птичьей клетки.

Рисунок 9

(A) Интегрированный радиочастотный приемник / B ₀ — матричная катушка регулировочной прокладки (AC / DC) (слева) и платы питания регулировочных прокладок с цифровым программированием (справа). (B) Трехмерная диаграмма последовательности импульсов MRSI с коррекцией движения в реальном времени и динамическим обновлением прокладок переменного / постоянного тока. Время эха TE = 78 мс (TE1 / TE2 = 50/28 мс), задержка восстановления инверсии TI = 270 мс, TR = 1800 мс, FOV = 220 × 220 × 80 мм ³ , матрица 44 × 44 × 8, номинальная воксель 5 × 5 × 10 мм ³ , спектральное окно 2700 Гц, время сбора данных = 11:38 мин: с. 2SH = сферические гармоники 2-го порядка; AC / DC = переменный / постоянный ток ; AHP = адиабатический полупроход; GOIA = адиабатический, независимый от смещения градиента; EPI = эхо-планарное изображение; HGSB = гипергеометрическая одинарная полоса; WET = подавление воды, усиленное эффектами T ₁ .Внизу показаны: B ₀ карты поля для шимминга 2SH и 2SH + ACDC; спиральная траектория выхода в k-пространстве; профиль среза импульсов GOIA, смоделированный для смещения ± 1 ppm; профиль инверсии импульса HGSB с переходной полосой с центром (красная пунктирная линия) при 1,6 ppm.

Петли катушки диаметром 9,5 см, изготовленные из сплошного провода AWG16, выстроены в гексагонально-пятиугольный узор с критическим перекрытием для разделения соседних элементов. Другие подробности катушки RF приведены в ^26,63 .Регулирующие токи катушки переменного / постоянного тока управлялись группой низковольтных усилителей с цифровым программированием, обеспечивающих постоянный ток до ± 2,5 А на канал и позволяющих очень быстро переключаться менее чем за 1 мс между различными шаблонами поля B ₀ ²⁸ . Устройства выходного каскада монтируются на радиаторах с проложенными трубопроводами для водяного охлаждения. ВЧ возбуждение достигалось с помощью регулируемой квадратурной катушки типа «птичья клетка». По бокам головы испытуемого были добавлены диэлектрические прокладки для улучшения однородности передачи B ₁₊ и достижения более однородного качества данных MRSI по всему мозгу ⁶⁴ .

Регулировочная прокладка AC / DC была наложена на регулировочную прокладку 2SH, созданную оборудованием сканера. В дополнение к различным комбинациям аппаратного обеспечения было исследовано несколько алгоритмов прокладки на основе целевого объема прокладки, который включал только мозг или представлял собой прямоугольную «коробку», включающую все отделы головы (мозг, кость и скальп) внутри плиты MRSI. Всего было изучено пять комбинаций шимминга: (1) 2SH _box , (2) 2SH _brain , (3) 2SH _box + AC / DC _brain , (4) 2SH _brain + AC / DC. _мозг и (5) (2SH _мозг + AC / DC _мозг ) _сустав .Коробка 2SH — это метод установки прокладок, предоставляемый производителем, к которому имеют доступ все пользователи. Ранее сообщалось о 2SH _brain ²⁰ для улучшения 2SH _box , и здесь нам нужно было исследовать, может ли регулировка по переменному / постоянному току обеспечить дальнейшее улучшение. Совместная оптимизация шимминга 2SH и AC / DC (2SH _brain + AC / DC _brain ) _сустав , как ожидается, позволит наилучшим образом использовать ортогональные пространственные базовые функции всех каналов шиммирования.Для расчета прокладки 2SH _box мы использовали поставляемое производителем программное обеспечение, используя три итерации прокладки с последовательностью двойного эхо-сигнала (DESS).

Для калибровки регулировочных катушек переменного / постоянного тока, для измерения поля B ₀ , вызванного каждым отдельным переменным / постоянным током, использовалась последовательность градиентных эхо-сигналов (GRE) с двумя эхосигналами (∆TE = 1,02 мс). прокладку катушки в большом фантоме, который полностью заполняет катушку. Та же самая последовательность отображения B ₀ также использовалась для калибровки регулировочных катушек 2SH сканера для регулировочной прокладки 2SH _brain .Во время предметных измерений были измерены полевые карты B ₀ с использованием той же последовательности. Все карты поля были получены с полем обзора (FOV) 224 × 224 × 200 мм ³ , размером матрицы 112 × 112 × 100 и 2 × 2 × 2 мм ³ изотропный воксель, время сбора данных 1: 55 мин: с. Изображение GRE разности фаз было пространственно развернуто с помощью FSL PRELUDE ⁶⁵ , преобразовано в карту поля B ₀ и передано на автономный компьютер, где оптимальные токи прокладки для 31 канала прокладки были вычислены менее чем за одну минуту с использованием программы Matlab » quadprog »(The MathWorks, Natick, MA).Одиночная итерация с прокладкой выполнялась следующим образом. Токи прокладки были рассчитаны с использованием штрафа по методу наименьших квадратов для ΔB ₀ с целью минимизировать стандартное отклонение ΔB ₀ на исследуемой пластине мозга, которая имела толщину 70 мм у всех испытуемых. Мозг был замаскирован с помощью FSL Brain Extraction Tool из магнитудного изображения первого эхо-сигнала GRE. Целевая функция представляет собой квадратичную программу с ограничениями линейного неравенства, обеспечивающими максимальный ток на канал (2 А) и полный ток на массив (25 А).Из-за малых токов происходит минимальный нагрев контуров, не требующий водяного охлаждения змеевика. Аналогичная оптимизация была проведена для 2SH _brain с использованием текущих ограничений и полевой калибровки регулировочных катушек сканера 1-го и 2-го порядка.

Поскольку регулировочная прокладка AC / DC оптимизирована для мозга, поле B ₀ может быстро изменяться за пределами мозга в подкожно-жировой клетчатке, и это может ухудшить подавление липидов, используемое нашей последовательностью. Чтобы избежать этой проблемы, запускающий импульс из последовательности используется для отключения регулировочной прокладки AC / DC непосредственно перед подавлением липидов.Второй пусковой импульс используется для повторного включения оптимальной прокладки переменного / постоянного тока непосредственно перед импульсами подавления воды. Из-за низкой индуктивности катушек и возможности быстрого переключения управляющей электроники, поля могут быть быстро обновлены во время сбора данных таким образом, без появления артефактов MRSI.

Таким образом, предлагаемая нами методология установки прокладок состоит из четырех компонентов: (1) Прокладка 2SH сканера, которая обеспечивает «базовую» прокладку, (2) Катушка переменного / постоянного тока, которая добавляет локализованные поля ΔB ₀ , ( 3) возможность динамически переключать эти поля переменного / постоянного тока в каждом TR, позволяя отдельно оптимизировать прокладку для обнаружения метаболитов и подавления липидов, (4) наше программное обеспечение прокладки, которое с большей готовностью, чем программное обеспечение прокладки сканера, позволяет регулировать только мозг вместо всей головы.

Получение и обработка MRSI

Последовательность 3D MRSI для всего мозга (рис. 9B) состояла из пяти модулей: (1) возбуждение пластины адиабатическим спин-эхом (ASE) ⁶⁶ с использованием импульса возбуждения AHP4 и двух модулей GOIA-W (16,4) импульсы перефокусировки; (2) подавление жира с восстановлением инверсии с использованием асимметричного адиабатического гипергеометрического (HGSB) импульса ⁶⁷ и времени инверсии 270 мс; (3) четырехимпульсный модуль WET ⁵ с общей длительностью 160 мс, который был оптимизирован для подавления воды при 7 Тл и разыгрывался во время инверсии; (4) набор спиральных траекторий выхода ^49,50 , рассчитанных на градиент 7 T-SC72CD; (5) объемный навигатор EPI, который чередовался с каждым TR для коррекции движения в реальном времени, картирования поля и коррекции дрейфа частоты ^{52, 53,68} .

Для возбуждения ASE использовался импульс AHP4 ⁶⁹ длительностью 4 мс, полоса пропускания 5 кГц, амплитуда 12 мкТл B ₁₊ и два импульса перефокусировки GOIA-W (16,4) ⁷⁰ длительностью 5 мс, 20 полоса пропускания кГц, 14 мкТл B ₁₊ амплитуда (на 20% выше адиабатического порога). Последовательность ASE представляет собой последовательность двойной перефокусировки, аналогичную PRESS, и время эхо-сигнала было оптимизировано для обнаружения 2HG при 7 T с использованием TE1 / TE2 = 58/20 мс (TE = 78 мс), как было предложено для последовательности PRESS ⁴⁵ .Моделированием было подтверждено, что аналогично PRESS, ASE с TE1 / TE2 = 58/20 мс дает отрицательный пик для 2HG при 2,25 ppm (рис. 1). Однако последовательность ASE имеет гораздо меньшую ошибку смещения химического сдвига (1,5% для 1 ppm при 7 T) по сравнению с PRESS ⁴⁷ (21% для 1 ppm при 7 T), а также компенсирует неоднородность пропускания B ₁₊ . Профиль среза импульсов GOIA, использованных в нашем исследовании MRSI, был смоделирован для смещения химического сдвига ± 1 ppm (рис. 9B) и указывает на минимальное значение (2.5%) искажение плоской вершины полосы пропускания в диапазоне химического сдвига 2 ppm. Также очевидны узкая переходная полоса (10% полосы пропускания) и отсутствие внеполосного возбуждения.

Импульс HGSB имел длительность 30 мс (A = 3,2842; B = 0,1751; C = -1,7; D = 1,4231; Ω = 9,1809), амплитуду 12 мкТл B ₁₊ , полосу инверсии 2 кГц и полосу перехода 90 Гц, который был сосредоточен на 1,6 ppm, обеспечивая полную инверсию ниже 1,4 ppm и не инверсию выше 1,8 ppm, следовательно, подавлял основные липидные пики при 1.2 и 0,9 ppm при сохранении SNR метаболита. Моделирование профиля инверсии HGSB показано на рис. 9B. Триггеры, размещенные до и после импульса HGSB, использовались для выключения / включения регулировки переменного / постоянного тока. В модуле WET использовались гауссовые импульсы с полосой пропускания 150 Гц, углами поворота 83,6 °, 99,7 °, 74,7 °, 160 ° и задержками между импульсами 40 мс. Спиральные траектории выхода были разработаны для человека 7 T MRSI со спектральным окном 2,7 кГц, полем обзора 220 × 220 мм ² и матрицей 44 × 44, что требовало максимальной амплитуды градиента G _max = 14 .19 мТл / м, а максимальная скорость нарастания S _max = 158,89 мТл / м / с. Конструкция со спиральным выходом исключает перемоточные устройства, используемые для спирального выхода, что увеличивает эффективность отбора проб и SNR MRSI ^49,50 .

Следующие параметры были использованы для получения 3D MRSI цельного мозга сляба: TR = 1800 мс; TE = 78 мс (TE1 / TE2 = 58/20 мс), TI = 270 мс; FOV 220 × 220 × 80 мм ³ ; матрица 44 × 44 × 8; номинальный размер вокселя 5 × 5 × 10 мм ³ ; спектральное окно 2,7 кГц; 24 угловых чередования, 2 временных чередования для спирального выхода; 8 фазовых кодировок; 1 средний; время сбора = 11:38 мин: сек.ASE возбудил пластинку мозга толщиной 60 мм, которая содержала шесть последовательных срезов MRSI с фазовым кодированием по 10 мм каждый. Плита с возбуждением ASE диаметром 60 мм была немного меньше, чем плита с прокладкой шириной 70 мм, чтобы обеспечить небольшой запас для перехода от неоднородного к однородному полю B ₀ . Для всех измерений MRSI удельная скорость поглощения (SAR) находилась в пределах 60–95% от максимального предела SAR, отслеживаемого системой МРТ. Параметры сбора навигатора: водоселективное возбуждение с углом поворота 2 °, TR = 8.8 мс, двойное эхо TE1 / TE2 = 3,5 / 4,5 мс, FOV 256 × 256 × 176 мм ³ , матрица 32 × 32×22, коэффициент EPI 16, частичная дискретизация Фурье 6/8, полоса 4596 Гц / пик, изотропный воксель 8 × 8 × 8 мм ³ и время сбора данных 0,6 с, как показано в Ref. ⁶⁸ .

В дополнение к данным о метаболитах MRSI, данные MRSI без подавления воды (матрица 22 × 22 × 8; время сбора данных 4:19 мин: с) были получены для комбинации катушек и фазирования спектров метаболитов. Катушечная комбинация данных метаболитов была выполнена с использованием S / N ² , взвешивая ^71,72 индивидуальных данных канала на основе данных по воде.После объединения катушек реконструкция не декартовых выборочных данных была выполнена с помощью неравномерного дискретного преобразования Фурье (NUDFT) ⁷³ с последующим удалением остаточного липидного сигнала со штрафом L1 ⁷⁴ и пространственной фильтрацией Хэмминга. Необработанные данные MRSI были реконструированы и проанализированы с помощью собственного пакета обработки с использованием MATLAB R2018b, Bash V4.2.25 (Free Software Foundation, Бостон, Массачусетс, США), MINC tools V2.0 (McConnell Brain Imaging Center, Монреаль, КК, США). Канада), FSL ⁷⁵ и Freesurfer ⁷⁶ .Спектры

MR были скорректированы по фазе / частоте и подогнаны с помощью LCModel ⁷⁷ между 1,8 и 4,2 ppm, с базисным набором, смоделированным в GAMMA ⁷⁸ с использованием тех же импульсов и градиентной модуляции, что и сканер, и включая 20 метаболитов: D-2-гидроксиглутарат (2HG), аспартат (Asp), креатин (Cr), гамма-аминомасляная кислота (GABA), глутамат (Glu), глутамин (Gln), глутатион (GSH), глицин (Gly), глицерофосфохолин (GPC). ), глицерофосфоэтаноламин (GPE), мио-инозитол (Ins), лактат (Lac), N-ацетиласпартат (NAA), N-ацетил-аспартилглутамат (NAAG), фосфохолин (PCh), фосфокреатин (PCr), фосфорилэтаноламин ( PE), сцилло-инозитол (Scy), серин (Ser) и таурин (Tau).Общая NAA (tNAA) представлена ​​как сумма вклада NAA и NAAG, общего холина (tCho) как суммы GPC и PCh и общего креатина (tCr) как суммы Cr и PCr. Обратите внимание, что сигналы макромолекул (ММ) при 2,25 ppm и 4 ppm, перекрывающих 2HG, имеют релаксацию T2 (T2 ~ 20 мс ^79,80 ) примерно в пять раз короче, чем релаксация T2 2HG при 7 T (T2 ~ 100 мс, предполагается аналогичное на глутамат ⁸¹ ), следовательно, сигналы MM будут затухать в 20 раз больше, чем 2HG для TE = 78 мс, что минимизирует потенциальное смещение количественной оценки 2HG из-за MM.Метаболические карты и параметрические карты качества для SNR, CRLB и ширины линии (FWHM, полная ширина, половина максимума) составляются для каждого набора данных MRSI, как оценивается с помощью процедуры подбора LCModel. Ширина линии менее 0,1 ppm и нижняя граница Крамера-Рао (CRLB) менее 20% и SNR> 10 использовались для определения приемлемого качества соответствия для количественной оценки метаболитов.

В дополнение к MRSI была получена трехмерная анатомическая визуализация с изотропным разрешением 1 мм с T ₂ Fluid Attenuated Inversion Recovery (FLAIR, TR = 5000 мс, TE = 335 мс, TI = 3100 мс) и T ₁ мультиэхо-MPRAGE (MEMPRAGE ⁸² , TR = 2550 мс, TE1 / TE2 / TE3 / TE4 = 1.57 / 3,35 / 5,13 / 6,91 мс, TI = 1100 мс, угол поворота 7 °) также были получены.

Люди

Три здоровых субъекта (2 женщины и 1 мужчина, возраст 28–33 лет) и один пациент с мутантной глиомой IDh2 (женщина, возраст 42 года) были измерены для проверки нашей методологии. Все эксперименты и методы проводились в соответствии с соответствующими инструкциями и правилами. Исследование было одобрено этическим комитетом Массачусетской больницы по этике, проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и руководящими принципами правительства США.Информированное согласие было получено от каждого субъекта с использованием протокола исследования, одобренного институциональным наблюдательным советом (IRB). Пациент с мутантной глиомой IDH ранее перенес операцию на опухоли головного мозга, и мутационный статус IDh2 был установлен иммуногистохимическим (ИГХ) анализом с использованием антитела против R132H человека (DIANOVA ⁸³ ), а также впоследствии подтвержден генетическим секвенированием (SNaPshot ^{). 84} ).

Все пять условий слияния не могли быть протестированы у всех четырех субъектов, потому что некоторые субъекты не могли выдержать всю двухчасовую продолжительность полного протокола визуализации.Данные 3D MRSI были измерены следующим образом: (a) 2SH _box и 2SH _box + AC / DC _brain у всех четырех субъектов; (б) 2SH _ящик , 2SH _мозг , 2SH _ящик + AC / DC _мозг , 2SH _мозг + AC / DC _мозг , (2SH _мозг + AC / DC _мозг ) _сустав у одного здорового добровольца; (c) 2SH _ящик , 2SH _мозг , 2SH _ящик + AC / DC _мозг , 2SH _мозг + AC / DC _мозг в пациенте.Мы выбрали для измерения 2SH _box и 2SH _box + AC / DC _brain у всех испытуемых, потому что сравнение этих двух условий прокладки является наиболее актуальным: (a) 2SH _box является инструментом для регулировки прокладок от производителя, используется всеми пользователями, и (b) 2SH _box + AC / DC _brain представляет собой наиболее справедливое сравнение для измерения улучшений регулировочных прокладок переменного / постоянного тока в дополнение к регулировочным прокладкам производителя. У двух субъектов (один здоровый и один пациент) мы исследовали дополнительные улучшения, которые были бы возможны, если бы лучшая прокладка, сфокусированная только на головном мозге (2SH _brain ), могла быть выполнена с помощью аппаратного сканера.Для пациента с глиомой отношение контрастности опухоли к шуму (CNR) в метаболических изображениях было рассчитано с использованием следующего определения \ (CNR: = \ frac {{mean \ left ({\ left [{Metab} \ right] _ {Tumor }} \ right) — означает \ left ({\ left [{Metab} \ right] _ {Background}} \ right)}} {{std \ left ({\ left [{Metab} \ right] _ {Background} } \ right)}} \), где [Metab] — концентрация метаболита в опухоли или вне опухоли (фон).

Измерения фантома

Структурно-метаболический фантом (рис. 2) был изготовлен на заказ с шестью трубками (диаметром 25 мм), расположенными симметрично внутри большего цилиндрического контейнера (диаметром 110 мм).Шесть пробирок содержали забуференный (pH = 7) раствор метаболитов головного мозга и 2HG следующим образом: (а) концентрация D-2HG была выбрана так, чтобы она была различной в шести отсеках, соответственно 0, 1, 2, 3, 4 и 5. мМ, в то время как (b) одинаковый фон метаболитов мозга использовался во всех компартментах, предполагая метаболический профиль опухоли с 6 мМ NAA, 8 мМ глутамата, 1 мМ ГАМК, 4 мМ креатина, 5 мМ холина, 8 мМ мио-инозитола и 4 мМ лактата. Пробирки были легированы магневистом 1 мл / л для укорочения T ₁ , в то время как снаружи пробирки использовался буферный водный раствор без метаболитов и магневиста для заполнения цилиндра.Все пять условий прокладки 2SH _box , 2SH _brain , 2SH _box + AC / DC _brain , 2SH _brain + AC / DC _brain , (2SH _brain + AC / DC _brain ) _сустав были использованы для проверки метаболической визуализации 3D MRSI на основании фактов.

Моделирование

Чтобы оценить влияние ширины линии на количественную оценку 2HG, мы выполнили квантово-механическое моделирование (GAMMA ⁷⁸ ) спектров опухоли головного мозга для различной ширины спектральной линии, исходя из параметров последовательности импульсов ASE, используемых in vivo.Спектры синтетических опухолей были получены путем объединения смоделированных спектров 14 метаболитов мозга и 2HG. Концентрация 2HG была установлена ​​на 5 мМ, в то время как для других 14 метаболитов концентрации были: 4 мМ глутамата, 7 мМ глутамина, 1 мМ ГАМК, 0,5 мМ глутатиона, 2 мМ глицина, 8 мМ миоионитола, 3 мМ лактата, 5 мМ NAA, 2 мМ NAAG, 2 мМ PC, 2 мМ GPC, 3 мМ Cr, 3 мМ PCr, 2 мМ таурин. T ₂ , время релаксации 132 мс для NAA, 152 мс для фосфохолина и глицерин-фосфохолина, 95 мс для Cr и PCr и 93 мс для всех других метаболитов, включая 2HG, считались ⁸¹ .

Чтобы имитировать эффекты неоднородности B ₀ , мы применили уширение линии в диапазоне 3–60 Гц (0,01–0,2 ppm при 7 T) с шагом 1 Гц (0,0033 ppm). После уширения линии во всех симуляциях был добавлен 10% белый шум, что дало SNR 50 для самой узкой ширины линии и SNR 10 для самой широкой ширины линии. Диапазон отношения сигнал / шум и ширина линии при моделировании покрывали диапазон, измеренный в спектрах in vivo. Смоделированные спектры были подогнаны с помощью LCModel ⁷⁷ , что эквивалентно экспериментальным спектрам.

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc. V4.03, Калифорния, США). Средние различия сравнивали с использованием непараметрического критерия Манна – Уитни с порогом статистической значимости, определяемым как P <0,05. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Корреляция Пирсона была проведена для фантомных измерений.

% PDF-1.4 % 1387 0 объект > эндобдж xref 1387 145 0000000016 00000 н. 0000004287 00000 н. 0000004487 00000 н. 0000004516 00000 н. 0000004568 00000 н. 0000004628 00000 н. 0000004885 00000 н. 0000005024 00000 н. 0000005161 00000 п. 0000005297 00000 н. 0000005437 00000 н. 0000005578 00000 н. 0000005716 00000 н. 0000005852 00000 н. 0000005998 00000 н. 0000006107 00000 н. 0000006216 00000 н. 0000006323 00000 н. 0000006407 00000 н. 0000006488 00000 н. 0000006571 00000 н. 0000006654 00000 н. 0000006737 00000 н. 0000006820 00000 н. 0000006903 00000 н. 0000006986 00000 н. 0000007069 00000 н. 0000007152 00000 н. 0000007235 00000 н. 0000007318 00000 н. 0000007401 00000 п. 0000007484 00000 н. 0000007567 00000 н. 0000007650 00000 н. 0000007733 00000 н. 0000007816 00000 н. 0000007899 00000 н. 0000007982 00000 н. 0000008065 00000 н. 0000008148 00000 н. 0000008231 00000 п. 0000008314 00000 н. 0000008397 00000 н. 0000008480 00000 н. 0000008563 00000 н. 0000008646 00000 н. 0000008729 00000 н. 0000008812 00000 н. 0000008895 00000 н. 0000008978 00000 н. 0000009061 00000 н. 0000009144 00000 п. 0000009227 00000 н. 0000009310 00000 п. 0000009393 00000 п. 0000009475 00000 н. 0000009557 00000 н. 0000009639 00000 н. 0000009721 00000 н. 0000009803 00000 н. 0000009885 00000 н. 0000009967 00000 н. 0000010049 00000 п. 0000010131 00000 п. 0000010212 00000 п. 0000010381 00000 п. 0000011265 00000 п. 0000011704 00000 п. 0000012220 00000 п. 0000012355 00000 п. 0000012611 00000 п. 0000012715 00000 п. 0000013043 00000 п. 0000016548 00000 п. 0000016988 00000 п. 0000017438 00000 п. 0000017684 00000 п. 0000018027 00000 п. 0000020778 00000 п. 0000021530 00000 н. 0000021798 00000 п. 0000022362 00000 п. 0000022643 00000 п. 0000023170 00000 п. 0000023407 00000 п. 0000051279 00000 п. 0000064454 00000 п. 0000089448 00000 н. 0000132891 00000 н. 0000165281 00000 н. 0000165370 00000 н. 0000170141 00000 п. 0000170389 00000 п. 0000170641 00000 п. 0000170701 00000 н. 0000170852 00000 н. 0000170949 00000 н. 0000171108 00000 н. 0000171221 00000 н. 0000171384 00000 н. 0000171543 00000 н. 0000171718 00000 н. 0000171893 00000 н. 0000172040 00000 н. 0000172149 00000 н. 0000172304 00000 н. 0000172497 00000 н. 0000172608 00000 н. 0000172789 00000 н. 0000172886 00000 н. 0000172993 00000 н. 0000173186 00000 н. 0000173307 00000 н. 0000173432 00000 н. 0000173581 00000 н. 0000173776 00000 н. 0000173967 00000 н. 0000174102 00000 н. 0000174235 00000 н. 0000174376 00000 н. 0000174497 00000 н. 0000174646 00000 н. 0000174803 00000 н. 0000174938 00000 н. 0000175101 00000 н. 0000175258 00000 н. 0000175411 00000 н. 0000175540 00000 н. 0000175719 00000 н. 0000175832 00000 н. 0000175981 00000 н. 0000176128 00000 н. 0000176261 00000 н. 0000176460 00000 н. 0000176587 00000 н. 0000176742 00000 н. 0000176881 00000 н. 0000177000 00000 н. 0000177159 00000 н. 0000177278 00000 н. 0000177407 00000 н. 0000177550 00000 н. 0000177677 00000 н. 0000177820 00000 н. 0000003196 00000 н. трейлер ] / Назад 630979 >> startxref 0 %% EOF 1531 0 объект > поток hb«`e`ua`! B cg`aXbabȹE @ bArCEaV.Y002, m ۋ # e4’ecXʂc1Å ~ p136F.c.: 0O @ sg’R01 ڠ 5 Cxy23

Вспышка болезни легионеров, вызванная эндемическим штаммом Legionella pneumophila, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США, 2015 — Том 23, номер 11 — ноябрь 2017 г. — Журнал Emerging Infectious Diseases

Принадлежность авторов: Центр Уодсворта, Олбани, Нью-Йорк, США (П. Лапьер, Э. Назарян, Ю. Чжу, Д. Вроблевски, А. Сэйлорс, Т. Пассаретти, Х.А. Цукер, К.А. Массер); Департамент здравоохранения и психической гигиены города Нью-Йорка, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США (S.Hughes, A. Tran, Y. Lin, J. Kornblum, R. Fitzhenry, D. Weiss, J.K. Варма, Дж. Л. Ракеман); Центры по контролю и профилактике заболеваний, Атланта, Джорджия, США (S.S. Morrison, J.W. Mercante, B.H. Raphael); Комиссар штата Нью-Йорк по здравоохранению, Олбани (Х.А. Цукер)

Легионелла видов вездесущи в природе, обитают в почве и воде и часто населяют искусственные водораспределительные системы, резервуары с горячей водой, декоративные фонтаны и градирни ( 1 , 2 ).Лица с сопутствующими заболеваниями, такими как хронические заболевания легких, или лица с ослабленным иммунитетом, подвергаются повышенному риску заражения болезнью легионеров (БЛ) (также называемой легионеллезом). Признаки и симптомы обычно включают жар, кашель и боль в груди; LD приводит к летальному исходу в ≈5–10% случаев ( 3 , 4 ). Передача Legionella pneumophila происходит в основном при контакте с загрязненными аэрозолями, а не от других инфицированных людей; на сегодняшний день зарегистрирован только 1 случай передачи вируса от человека к человеку ( 4 , 5 ).

LD был первоначально обнаружен в 1976 году, когда произошла вспышка болезни во время собрания Американского легиона в Филадельфии, штат Пенсильвания, США; Выявлен 221 случай, 34 инфицированных умерли ( 6 ). Вспышка, которая остается самой крупной вспышкой LD в Соединенных Штатах, связанной с населением, позже была связана с системой охлаждения в отеле, и бактерия, классифицированная как L. pneumophila серогруппы 1, была впоследствии выделена у 4 человек ( 7 , 8 ).

Рисунок 1

Рис. 1. Вспышка болезни легионеров, вызванная эндемическим штаммом Legionella pneumophila , г. Нью-Йорк, Нью-Йорк, США, 2015 г. На временной шкале показаны все диагностированные случаи, связанные с июлем 2015 г. Южный Бронкс и …

Летом 2015 года крупная вспышка LD, связанная с населением, затронула людей, которые проживали или путешествовали по большой территории в районе Южного Бронкса в Нью-Йорке, штат Нью-Йорк, США. В период со 2 июля по 3 августа в общей сложности 138 взрослых с LD были связаны со вспышкой; 128 пациентам потребовалась госпитализация, 16 человек погибли (рис. 1).Совместное лабораторное исследование для поиска источника этой вспышки было проведено Департаментом здравоохранения и психической гигиены города Нью-Йорка и Лабораторией общественного здравоохранения (NYC PHL), Центром Уодсворта (WC) Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк (Олбани). , Нью-Йорк, США) и Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC; Атланта, Джорджия, США).

Гель-электрофорез в импульсном поле (PFGE), ПЦР в реальном времени, типирование на основе последовательностей (SBT) и полногеномное секвенирование (WGS) были использованы для характеристики человека и окружающей среды L.pneumophila из исследования. Эпидемиологические данные и тестирование воды с помощью ПЦР быстро привели к идентификации градирни, расположенной на крыше отеля в Южном Бронксе, как потенциального источника этой вспышки ( 9 ). Однако изолятов L. pneumophila , выделенных из образца, взятого позже во время вспышки из приюта для бездомных, расположенного поблизости от отеля Южного Бронкса и других учреждений в зоне очага, имели паттерны PFGE и SBT, идентичные таковым для штамм вспышки, что повышает вероятность того, что отель в Южном Бронксе мог быть не единственным источником аэрозольных видов Legionella , связанных со случаями легионеллеза.Наше обнаружение высокородственных изолятов L. pneumophila в нескольких образцах окружающей среды и из прошлых вспышек LD предполагает присутствие потенциально патогенного эндемичного штамма в сообществе Бронкса.

Образцы воды и клинические изоляты

Первоначально образцы воды и мазков были собраны Департаментом здравоохранения и психической гигиены Нью-Йорка и распределены между WC и NYC PHL. Позже во время вспышки образцы воды и мазков были также собраны Департаментом здравоохранения штата Нью-Йорк и отправлены в WC.Образцы обрабатывали, как описано ( 9 ), за исключением подмножества образцов, включая образцы мазков и явно сложные образцы, которые не концентрировались центрифугированием, а тестировались напрямую. Клинические изоляты были получены NYC PHL и отправлены в WC. Подмножество водных и клинических изолятов было отправлено в CDC для анализа SBT или секвенирования с использованием платформы RSII (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, USA). SBT проводился в соответствии с Исследовательской группой Европейского общества клинической микробиологии и инфекционных заболеваний (Базель, Швейцария) для Legionella Infections Scheme ( 10 , 11 ).

Извлечение ДНК

Экстракцию нуклеиновой кислоты

проводили для образцов воды и мазков с использованием модифицированной процедуры набора для выделения ДНК Masterpure (Эпицентр, Мэдисон, Висконсин, США) ( 12 ). Вкратце, для каждой экстракции суспензию изолята по Макфарланду 1,2–1,5 в стерильной воде центрифугировали в течение 10 мин при 7500 об / мин. Объем 950 мкл супернатанта удаляли, оставляя 50 мкл. Затем к каждому образцу добавляли в общей сложности 300 мкл 2х буфера для лизиса тканей и клеток, содержащего 1,5 мкл протеиназы К.Каждая экстракция включала отрицательный контроль экстракции, который состоял из 50 мкл стерильной воды. ДНК ресуспендировали в 100 мкл 10 ммоль / л Трис. Концентрации ДНК определяли количественно с использованием набора Qubit ds DNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в соответствии с инструкциями производителя с флуорометром Qubit 2.0 перед WGS. Обновления протокола включают добавление внутреннего контроля запрета.

Скрининг ПЦР

Мы протестировали обработанные образцы на ДНК Legionella с помощью ПЦР в реальном времени с новой проверенной и более всеобъемлющей процедурой, чем ранее опубликованная ( 12 , 13 ), для быстрого скрининга образцов для определения приоритетов культивирования.Этот анализ выявляет и дифференцирует Legionella spp., L. pneumophila и L. pneumophila серогруппы 1 и использует внутренний контроль для оценки ингибирующих веществ в образце.

Культура проб воды

Образцы, в которых было обнаружено L. pneumophila серогруппы 1, обрабатывали и культивировали в WC и NYC PHL с использованием стандартных методов. Изоляты были идентифицированы как L. pneumophila серогруппы 1 с помощью прямого флуоресцентного тестирования антител или ПЦР в реальном времени.Все изоляты L. pneumophila серогруппы 1 были первоначально типированы с использованием расщепления с Sfi 1 и гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE), как описано ( 14 ).

WGS

Секвенирование ДНК

было выполнено с использованием платформы MiSeq (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США) в WC Applied Genomic Technologies Core и платформы RSII (Pacific Biosciences) в CDC. Библиотеки индивидуальных образцов были подготовлены с использованием протокола Nextera XT (Illumina) для секвенирования.PacBio-совместимые библиотеки были сконструированы с использованием 8 мкг разрезанной геномной ДНК (≈15 т.п.н.), полученной с использованием набора SMRTbell Template Prep Kit 1.0 (номер продукта [PN] 100–259–100; Pacific Biosciences) в соответствии с протоколом производителя (PN 100-092-800-06), калькулятора связывания PacBio версии 2.3.11, комплекта связывания ДНК-полимеразы P6 версии 2 (номер по каталогу 100-372-700) и комплекта MagBead (номер по каталогу 100-133600).

запусков секвенирования выполняли с внутренним контролем ДНК размером 2 т.п.н. (номер по каталогу 100-356-500), длительностью фильма 240 мин и началом этапа с помощью набора реагентов для секвенирования ДНК 4.0 (ПН 100-356-400). Окончательный размер библиотеки был подтвержден с помощью Agilent Tapestation 2200 и ленты Genomic DNA ScreenTape (5067–5365 и 5067–5366). Версия 3 процесса иерархической сборки генома была использована для конструирования полных последовательностей генома L. pneumophila ( 15 ). Ожидаемый размер генома был установлен на 3,4 Мб, а параметр охвата целевого генома был установлен на 15 ×. Минимальное значение длины субпоследовательности было скорректировано для уменьшения покрытия генома до рекомендованных 100 × -150 × для микробных геномов ( 16 ).Закрытие генома было выполнено путем идентификации и обрезки перекрытия нуклеотидов на концах отдельных собранных последовательностей контигов с помощью Gepard версии 1.3 ( 17 ), а переформатированная последовательность генома использовалась в качестве входных данных для протокола RS-ReSequencing на портале анализа SMRT для построить полированную последовательность генома.

Чтобы подтвердить точность нуклеотидов, мы выровняли данные Illumina по парным концам для каждого секвенированного изолята с его соответствующей полированной последовательностью PacBio с помощью Bowtie версии 2.1.0 ( 18 ). Мы использовали Samtools версии 0.1.18 ( 19 ) и FreeBayes версии 0.9.21 ( 20 ) для выявления нуклеотидных расхождений между двумя типами данных. Мы устранили все расхождения с набором данных Illumina и использовали VCFtools версии 0.1.11 (http://vcftools.sourceforge.net/) для построения окончательной согласованной последовательности с использованием обоих типов данных ( 21 ). Мы депонировали закрытую последовательность генома штамма вспышки болезни Южного Бронкса F4469 в GenBank (инвентарный номер.CP014760). Все необработанные чтения Illumina, использованные в этом исследовании, доступны в BioProject (номер доступа PRJNA345011) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/).

Биоинформатический анализ

Мы сопоставили необработанные считывания со штаммом вспышки болезни Южного Бронкса F4469 с помощью BWA MEM версии 0.7.5a-r405 ( 22 ). Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) вызывались с использованием Samtools / BCFtools версии 0.1.19–44428cd ( 19 ), минимум Q20 для качества отображения и качества базового вызова, 10-кратной минимальной глубины и 95% согласований чтения аллелей.Позиции, где было обнаружено, что> 1 образцов имеют мутацию, были проверены вручную и использованы для построения выравнивания SNP. Позиции с неоднозначными вызовами в любой из выборок отбрасывались. Мы импортировали полученное выравнивание в PHYLOVIZ ( 23 ) и построили минимальное остовное дерево, используя алгоритм полного минимального остовного дерева GoeBURST (https://github.com/apetkau/microbial-informatics-2014/tree/master/labs/ мст). Присутствие плазмид проверяли путем сборки различных изолятов de novo в версии 3 SPAdes.7,0 ( 24 ) и сравнивается с помощью Mauve ( 25 ). События рекомбинации определялись путем нахождения областей с повышенной плотностью SNP с использованием вычисления функции плотности вероятности и Fastgear ( 26 ). Сравнение геномов бластного кольца проводили с использованием BRIG ( 27 ).

Компания

WC протестировала 289 проб воды из 183 градирен с помощью ПЦР в реальном времени во время расследования вспышки. В общей сложности 162 (88,5%) градирни дали положительный результат на ДНК видов Legionella . ДНК L. pneumophila обнаружена в 87 (47,5%) градирнях; 52 (28,4%) градирни были положительными L. pneumophila серогруппы 1, а 21 (11,5%) показала отрицательные или неубедительные результаты.

Рисунок 2

Рис. 2. Гель-электрофорез в импульсном поле (PFGE) изолятов случай-пациент и из окружающей среды из вспышки болезни легионеров, вызванной эндемическим штаммом Legionella pneumophila , Нью-Йорк, Нью-Йорк, США, 2015.Один клинический …

На основании количества присутствующей ДНК, которое было определено с помощью начального скрининга ПЦР, в период с 28 июля по 14 августа 2015 г. было культивировано 26 образцов воды из градирни. Мы идентифицировали 10 градирен с положительной культурой, из которых 15 л. pneumophila серогруппы 1 подвергали PFGE. Кроме того, культура в NYC PHL идентифицировала изоляты из градирни приюта для бездомных, которые были идентичны PFGE и включены в этот анализ. Эти л.pneumophila серогруппы 1 результаты PFGE показали 7 паттернов PFGE (рис. 2). PFGE показал, что изоляты из отеля Южного Бронкса и приюта для бездомных идентичны клиническим изолятам. Анализ SBT показал, что эти изоляты также имели тот же тип последовательности (т.е. 731).

WGS использовался в реальном времени во время вспышки LD в Южном Бронксе в качестве подтверждающего метода и для получения дополнительной информации об источнике. Впоследствии расследование также использовало WGS, чтобы уточнить, мог ли штамм вспышки присутствовать в других местах во время вспышки или в другое время в прошлом.В общей сложности 156 изолятов L. pneumophila серогруппы 1 были доступны из культур, проведенных в WC, PHL Нью-Йорка и больничных лабораториях (115 экологических и 41 клинический изолят от 26 пациентов, из которых 35 были респираторными и 6 были посмертными образцами от 3 пациента). Эти изоляты были секвенированы и проанализированы с использованием собственной биоинформатической программы, разработанной в WC.

Рисунок 3

Рис. 3. Минимальное остовное дерево из 77 изолятов, связанных со вспышкой болезни легионеров Южного Бронкса в 2015 г., вызванной эндемическим штаммом Legionella pneumophila , Нью-Йорк, Нью-Йорк, США, 2015 г.Дом …

Большинство (106/115) изолятов L. pneumophila серогруппы 1 из окружающей среды не полностью соответствовали ни одному из клинических изолятов L. pneumophila серогруппы 1, предположительно являющихся частью этой вспышки, и различались на несколько тысяч SNP по сравнению с в качестве эталона использовали геном размером 3,4 мб из гостиничного штамма Южного Бронкса F4469. Пять изолятов L. pneumophila серогруппы 1, выделенных из отеля Южного Бронкса, и 41 клинический изолят L. pneumophila серогруппы 1 от 26 пациентов, связанных с этой вспышкой, были идентичны (между ними нет различий по SNP) (рис.Восемь других клинических изолятов L. pneumophila серогруппы 1 (15–144, 15–157, 15–158, 15–202, 15–209, 15–215, 15–273 и 15–288), полученных во время той же вспышки. период имел те же типы PFGE и SBT, что и изоляты вспышки. Однако эти 8 изолятов не соответствовали определению эпидемиологического случая ( 9 ), и WGS показал, что они содержат 1–5 отличий по SNP по сравнению с изолятом из отелей Южного Бронкса.

Четыре изолята из окружающей среды (3 изолята из одного приюта для бездомных и 1 из колледжа Восточного Бронкса), полученные в ходе расследования вспышки болезни в Южном Бронксе (рис. 2), были почти идентичны изоляту из отеля в Южном Бронксе, каждый из них отличался только на 1 или 2 единицы. SNP из отеля в Южном Бронксе изолированы друг от друга.Все 3 изолята из приюта для бездомных имели одинаковый уникальный SNP, который отсутствовал у всех клинических и экологических изолятов, связанных с отелем Южного Бронкса. Более того, изолят колледжа Восточного Бронкса, который был получен на участке в нескольких километрах от отеля Южного Бронкса, был идентичен WGS с 1 клиническим изолятом Южного Бронкса (15–273). Пять других клинических изолятов (15–288, 15–215, 15–157, 15–158 и 15–202) имели профили SNP, которые были ближе к изоляту, полученному из колледжа Восточного Бронкса, чем к изоляту, полученному из Южного Бронкса. отель.В совокупности эти наблюдения предполагают, что 1) градирня отеля в Южном Бронксе и никакие другие градирни, скорее всего, была источником вспышки болезни в Южном Бронксе; и 2) случаи, эпидемиологически не связанные со вспышкой, могли происходить из других источников окружающей среды.

Мы также выполнили WGS для 10 исторических клинических изолятов ДНК L. pneumophila серогруппы 1 из Нью-Йорка, штат Нью-Йорк, и включили 3 последовательности генома из ранее опубликованного исследования ( 14 ), в котором сообщалось об идентичных или аналогичных образцах и последовательности PFGE. типы с таковыми из штамма гостиничной вспышки Южного Бронкса.Эти геномы отличались менее чем на 5 SNP от геномов гостиничных изолятов Южного Бронкса. Самый старый изолят L. pneumophila серогруппы 1, датированный 2007 годом, имел только 3 различия по SNP, что указывает на то, что изолят, вызвавший текущую вспышку, присутствовал в Бронксе более 8 лет. Два клинических изолята и 1 изолят из окружающей среды (Nh2, Nh3 и Nh4), полученные во время вспышки в доме престарелых Бронкса в 2011–2012 гг., Также оказались близкими родственниками гостиничного изолята Южного Бронкса (<3 различий в SNP), что указывает на что этот изолят вызвал> 1 предыдущую вспышку LD.Сравнение WGS 4 других клинических изолятов (09–214, 10–351, 10–423 и 10–458) в 2009 и 2010 гг. Показало профиль SNP, идентичный профилю 3 клинических изолятов 2015 г. (15–157 , 15–158 и 15–202), не связанными эпидемиологически со вспышкой болезни, связанной с отелем в Южном Бронксе. Эти клинические изоляты 2015 года отличались от изолята из отелей Южного Бронкса на 3 SNP, что позволяет предположить, что пациенты могли быть инфицированы от независимого источника, который не был идентифицирован. Помимо SNP, в некоторых проанализированных геномах были обнаружены и другие геномные различия, такие как наличие плазмид или больших инделей.

WGS-анализ 6 изолятов L. pneumophila серогруппы 1 из второй вспышки позднего лета 2015 г. в районе Восточного Бронкса (15 случаев, 4 клинических изолята и 2 последовательности изолята из окружающей среды), которые, как предполагалось, не были связаны с Было подтверждено, что июльская вспышка не связана (1 038 различий в SNP) по сравнению со штаммом, вызванным вспышкой в ​​отелях Южного Бронкса. Однако более тщательное изучение местоположения SNP показало, что большинство различий были сильно сгруппированы в нескольких геномных местоположениях, а не случайным образом рассредоточены по геному, и, возможно, были результатом событий рекомбинации.Когда эти места рекомбинации не учитывались, осталось только 8 различий в SNP. Кластеризация SNP на изогенном фоне предполагает, что штаммы Восточного Бронкса и Южного Бронкса только недавно разошлись после событий горизонтального переноса генов. WGS был единственным достаточно мощным методом, чтобы отличить отель Южного Бронкса от всех других экологических изоляторов, включая приют для бездомных, и подтвердил, что градирня отеля Южного Бронкса является источником этой вспышки.

Это расследование вспышки представляет собой широкомасштабное испытание лабораторий общественного здравоохранения Нью-Йорка PHL, WC и CDC.Как сообщает Weiss et al. ( 9 ), экологическое и эпидемиологическое расследование предоставило исчерпывающий набор проб и образцов для лабораторных исследований.

Крупные вспышки LD могут возникать в районах с высокой плотностью населения, которые находятся вблизи созданных человеком резервуаров и механизмов аэрозолизации, таких как градирни ( 28 — 30 ). Предотвращение или борьба с такими вспышками в городских районах дополнительно осложняется наличием множества потенциальных резервуаров, которые создают серьезные проблемы при попытке определить точный точечный источник.В метагеномном исследовании проб воздуха, полученных в Нью-Йорке, штат Нью-Йорк, преобладающим родом, идентифицированным в образцах, собранных с крыши офисного здания с видом на центр Манхэттена, было Legionella ( 31 ). Дальнейшее усложнение эпидемиологических исследований показало, что аэрозоли, содержащие L. pneumophila , способны инфицировать людей, проживающих на расстоянии> 6 км от источника заражения ( 32 ).

Наши находки аналогичных L.pneumophila в нескольких местах и ​​в течение продолжительных периодов времени согласуется с результатами этих исследований и дополнительно предполагает, что L. pneumophila способна выживать в течение длительного времени в нескольких резервуарах на больших территориях в городской среде. Наши результаты также предполагают, что градирни, колонизированные L. pneumophila , могут заражать другие участки, расположенные поблизости, что приводит к возможности для эндемичного штамма возобновить колонизацию после уничтожения организма в любом единственном предполагаемом источнике.Этот анализ предупреждает нас, что из-за особой биологической и экологической природы L. pneumophila полагаться только на один источник доказательств (эпидемиологические подходы или молекулярные данные) может быть недостаточно для определения точных источников вспышек легионеллеза.

Наш обширный отбор проб и WGS изолятов градирен показал, что многие градирни были заселены разнообразной и гетерогенной популяцией Legionella , большинство из которых не вызвали выявляемых заболеваний человека.В конкретном случае с градирней отеля Южного Бронкса было получено 2 различных штамма L. pneumophila серогруппы 1 (из 10 извлеченных изолятов), включая штамм, вызвавший вспышку 2015 года. Это открытие показало, что популяции вирулентных клонов могут сосуществовать среди широкого разнообразия незапланированных штаммов, не связанных с известным заболеванием и вирулентность которых не оценивалась.

До сих пор неясно, что вызвало вспышку LD в Нью-Йорке, штат Нью-Йорк, в 2015 году, но на это могли повлиять несколько факторов.Неправильное обслуживание градирен или чрезмерный туман, образующийся во время работы, могли создать идеальные условия для Legionella spp. для размножения и распыления ( 33 , 34 ). Кроме того, новая субпопуляция Legionella могла бы приобрести в результате мутации или рекомбинации новые полезные фенотипические возможности (например, повышенную устойчивость к чистящим средствам), лучшую выживаемость при высыхании или повышенную способность к аэрозолизации ( 35 — 37 ) .Низкий уровень гетерогенности, наблюдаемый между историческими изолятами и изолятами 2015 года, согласуется с результатами аналогичного исследования персистирующего штамма L. pneumophila серогруппы 1, ассоциированного со вспышкой заболевания, в Алькой, Испания, где было установлено, что частота мутаций для L. pneumophila в градирнях может составлять всего ≈0,15 SNP / геном / год (или 1 мутация во всем геноме каждые 6,7 лет) ( 38 ). Эта оценка повышает вероятность того, что L. pneumophila может сохраняться в неизменном виде в течение длительных периодов времени в состоянии покоя, пока не будет реактивировано благоприятными условиями окружающей среды.

Рисунок 4

Рисунок 4. Сравнение генома бластного кольца Legionella pneumophila штаммов из исследования вспышки болезни легионеров, вызванной эндемичным штаммом L. pneumophila , Нью-Йорк, Нью-Йорк, США, 2015. Сравнение …

Анализ генома штамма вируса вспышки Южного Бронкса выявил несколько вариабельных областей, многие из которых связаны с факторами вирулентности, по сравнению с 5 предшествующими вспышками L.pneumophila (рисунок 4). Две области, одна из которых содержит гены, кодирующие систему секреции IVA F-типа, и одна, кодирующая Legionella U-box типа E3 лигазы / эффекторные белки, также присутствуют в штаммах Philadelphia 1 и Paris 1976 года, но отсутствуют в других проанализированных штаммах. Штамм F4469, вызванный вспышкой болезни Южного Бронкса, также содержит расширенную изоформу повторов в гене структурного токсина ( rtxA ), аналогичную той, что обнаружена в штаммах Corby и Alcoy. Наконец, 2 геномных острова, один из которых содержит систему токсин-антитоксин генов А и В гидролиза гиппурата, а также другие гипотетические гены, и один, содержащий в основном не охарактеризованные гены, оказались уникальными для штамма Южного Бронкса.BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) поиск по этим 2 регионам обнаружил совпадения с частичной гомологией с другими штаммами L. pneumophila в Национальном центре биотехнологии (Бетесда, Мэриленд, США). ) неизбыточная база данных. Потребуются дальнейшие лабораторные исследования для определения роли этих островков, если таковые имеются, в патогенности этого штамма.

Наш анализ показал присутствие штамма L. pneumophila F4469 в Бронксе с 2007 г. в нескольких местах, связанных с различными вспышками и спорадическими ЛД.Хотя неясно, почему идентифицированная градирня способствовала такому количеству случаев, наши результаты показывают, что существует стойкий и патогенный эндемический штамм, который может представлять риск будущих вспышек. Обычно считается, что градирни засеваются муниципальными водопроводными сетями, и хотя этот фактор может быть правдой, в густонаселенных районах, таких как Нью-Йорк, Нью-Йорк, перекрестное загрязнение между градирнями вполне возможно. Это загрязнение потенциально может привести к восстановлению л.pneumophila в градирнях после дезактивации и вызывают длительное сохранение эндемичных штаммов в сообществах. Следовательно, строгие протоколы, касающиеся эксплуатации, технического обслуживания и очистки градирни, такие как те, которые предусмотрены недавним законодательством штатов Нью-Йорк и города Нью-Йорк, могут помочь минимизировать риски, связанные с локально циркулирующими штаммами L. pneumophila ( 39 , 40). ).

Доктор Лапьер — научный сотрудник Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк, Центр Уодсворта, Олбани, штат Нью-Йорк.Его научные интересы — бактериальная геномика и анализ последовательностей нового поколения, применяемый к проблемам общественного здравоохранения.

Вершина

Мы благодарим Центр прикладных геномных технологий Центра Уодсворта за полногеномное секвенирование, сотрудников лабораторий клинической микробиологии Департамента здравоохранения и психической гигиены города Нью-Йорка и Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк за сбор образцов воды из градирни; и Департаменту здравоохранения и психической гигиены г. Нью-Йорка для проведения первоначального подтверждающего тестирования с помощью посева, тестирования PFGE и предоставления изолятов.

Это исследование было поддержано Центрами по контролю и профилактике заболеваний (грант CK14-140102-PPHF16).

P.L. разработал пайплайн биоинформатики, провел анализ данных и написал статью; E.N., K.A.M., Y.Z., D.W. и T.P. участвовал в лабораторных исследованиях и отчетности; и S.H., A.T., Y.L., J.K., R.F., D. Weiss, J.K.V., H.A.Z, J.L.R, S.S.M., B.H.R. и J.W.M. участвовал в расследовании и внес свой вклад в рукопись.

Выводы, выводы и мнения, высказанные авторами, пишущими для этого журнала, не обязательно отражают официальную позицию U.S. Министерство здравоохранения и социальных служб, Служба общественного здравоохранения, Центры по контролю и профилактике заболеваний или аффилированные с авторами учреждения. Торговые наименования используются только для идентификации и не подразумевают одобрения какой-либо из вышеперечисленных групп.

% PDF-1.5 % 4 0 obj > эндобдж 7 0 объект (Содержание) эндобдж 8 0 объект > эндобдж 11 0 объект (Обозначения) эндобдж 12 0 объект > эндобдж 15 0 объект (I Информационные меры) эндобдж 16 0 объект > эндобдж 19 0 объект (1 Информационные меры: энтропия и дивергенция) эндобдж 20 0 объект > эндобдж 23 0 объект (1.1 Энтропия) эндобдж 24 0 объект > эндобдж 27 0 объект (1.2 Энтропия: аксиоматическая характеристика) эндобдж 28 0 объект > эндобдж 31 0 объект (1.3 История энтропии) эндобдж 32 0 объект > эндобдж 35 0 объект (1.4 * Энтропия: субмодулярность) эндобдж 36 0 объект > эндобдж 39 0 объект (1.5 * Энтропия: неравенство Хана и лемма Ширера) эндобдж 40 0 объект > эндобдж 43 0 объект (1.6 Дивергенция) эндобдж 44 0 объект > эндобдж 47 0 объект (1.7 Дифференциальная энтропия) эндобдж 48 0 объект > эндобдж 51 0 объект (2 Информационные меры: взаимная информация) эндобдж 52 0 объект > эндобдж 55 0 объект (2.1 Дивергенция: основное неравенство) эндобдж 56 0 объект > эндобдж 59 0 объект (2.2 Условное расхождение) эндобдж 60 0 объект > эндобдж 63 0 объект (2.3 Взаимная информация) эндобдж 64 0 объект > эндобдж 67 0 объект (2.4 Условная взаимная информация и условная независимость) эндобдж 68 0 объект > эндобдж 71 0 объект (2.5 Сильное неравенство в обработке данных) эндобдж 72 0 объект > эндобдж 75 0 объект (2.6 * Как избежать проблем с измеримостью?) эндобдж 76 0 объект > эндобдж 79 0 объект (3 Достаточная статистика. Непрерывность расхождений и взаимная информация) эндобдж 80 0 объект > эндобдж 83 0 объект (3.1 Достаточная статистика и обработка данных) эндобдж 84 0 объект > эндобдж 87 0 объект (3.2 Геометрическая интерпретация взаимной информации) эндобдж 88 0 объект > эндобдж 91 0 объект (3.3 Вариационные характеристики дивергенции: Донскер-Варадхан) эндобдж 92 0 объект > эндобдж 95 0 объект (3.4 Вариационные характеристики дивергенции: Гельфанд-Яглом-Перес) эндобдж 96 0 объект > эндобдж 99 0 объект (3.5 Непрерывность расходимости. Зависимость от -алгебры.) эндобдж 100 0 объект > эндобдж 103 0 объект (3.6 Вариационные характеристики и непрерывность взаимной информации) эндобдж 104 0 объект > эндобдж 107 0 объект (4 Экстремизация взаимной информации: седловая точка емкости) эндобдж 108 0 объект > эндобдж 111 0 объект (4.1 Выпуклость информационных мер) эндобдж 112 0 объект > эндобдж 115 0 объект (4.2 * Локальное поведение дивергенции) эндобдж 116 0 объект > эндобдж 119 0 объект (4.3 * Локальное поведение дивергенции и информация Фишера) эндобдж 120 0 объект > эндобдж 123 0 объект (4.4 Исключение взаимной информации) эндобдж 124 0 объект > эндобдж 127 0 объект (4.5 Вместимость = информационный радиус) эндобдж 128 0 объект > эндобдж 131 0 объект (4.6 Существование caod \ (общий случай \)) эндобдж 132 0 объект > эндобдж 135 0 объект (4.7 Гауссова седловая точка) эндобдж 136 0 объект > эндобдж 139 0 объект (5 Однобуквенный.Вероятность ошибки. Скорость энтропии.) эндобдж 140 0 объект > эндобдж 143 0 объект (5.1 Экстремизация взаимной информации для источников и каналов без памяти) эндобдж 144 0 объект > эндобдж 147 0 объект (5.2 * Гауссова емкость через ортогональную симметрию) эндобдж 148 0 объект > эндобдж 151 0 объект (5.3 Информационные меры и вероятность ошибки) эндобдж 152 0 объект > эндобдж 155 0 объект (5,4 энтропии) эндобдж 156 0 объект > эндобдж 159 0 объект (5.5 Энтропия и частота ошибок символа \ (бит \)) эндобдж 160 0 объект > эндобдж 163 0 объект (5.6 Скорость взаимной информации) эндобдж 164 0 объект > эндобдж 167 0 объект (5.7 * матрицы Теплица и теорема Сег \ 366) эндобдж 168 0 объект > эндобдж 171 0 объект (6 f-расхождений: определение и свойства) эндобдж 172 0 объект > эндобдж 175 0 объект (6.1 f-расходимости) эндобдж 176 0 объект > эндобдж 179 0 объект (6.2 Неравенство обработки данных) эндобдж 180 0 объект > эндобдж 183 0 объект (6.3 Полная вариативность и проверка гипотез) эндобдж 184 0 объект > эндобдж 187 0 объект (6.4 Мотивационный пример: проверка гипотез на нескольких выборках) эндобдж 188 0 объект > эндобдж 191 0 объект (6.5 Неравенства между f-расходимостями) эндобдж 192 0 объект > эндобдж 195 0 объект (7 неравенств между \ 040f -расхождениями через объединенный диапазон) эндобдж 196 0 объект > эндобдж 199 0 объект (7.1 Неравенства через общий диапазон) эндобдж 200 0 объект > эндобдж 203 0 объект (7.2 Примеры) эндобдж 204 0 объект > эндобдж 207 0 объект (7.3 Совместный диапазон различных расхождений) эндобдж 208 0 объект > эндобдж 211 0 объект (II Сжатие данных без потерь) эндобдж 212 0 объект > эндобдж 215 0 объект (8 сжатий без потерь переменной длины) эндобдж 216 0 объект > эндобдж 219 0 объект (8.1 Оптимальный компрессор переменной длины, без потерь) эндобдж 220 0 объект > эндобдж 223 0 объект (8.2 Однозначно декодируемые коды, префиксные коды и коды Хаффмана) эндобдж 224 0 объект > эндобдж 227 0 объект (9 Сжатие фиксированной длины \ (почти без потерь \). Slepian-Wolf.) эндобдж 228 0 объект > эндобдж 231 0 объект (9.1 Код фиксированной длины, почти без потерь, AEP) эндобдж 232 0 объект > эндобдж 235 0 объект (9.2 Линейное сжатие) эндобдж 236 0 объект > эндобдж 239 0 объект (9.3 Сжатие с дополнительной информацией как в компрессоре, так и в декомпрессоре) эндобдж 240 0 объект > эндобдж 243 0 объект (9.4 Slepian-Wolf \ (Сжатие с дополнительной информацией только в декомпрессоре \)) эндобдж 244 0 объект > эндобдж 247 0 объект (9.5 Многоконечный Слепянский волк) эндобдж 248 0 объект > эндобдж 251 0 объект (9.6 * Кодирование исходного кода с помощью помощника \ (Ahlswede-K \ 366rner-Wyner \)) эндобдж 252 0 объект > эндобдж 255 0 объект (10 Сжатие стационарных эргодических источников) эндобдж 256 0 объект > эндобдж 259 0 объект (10.1 Биты эргодической теории) эндобдж 260 0 объект > эндобдж 263 0 объект (10.2 Доказательство Шеннон-Макмиллан) эндобдж 264 0 объект > эндобдж 267 0 объект (10.3 * Доказательство Биркгофа-Хинчина) эндобдж 268 0 объект > эндобдж 271 0 объект (10.4 * Теорема Синая о генераторе) эндобдж 272 0 объект > эндобдж 275 0 объект (11 Универсальное сжатие) эндобдж 276 0 объект > эндобдж 279 0 объект (11.1 Арифметическое кодирование) эндобдж 280 0 объект > эндобдж 283 0 объект (11.2 Комбинаторная конструкция Фитингофа) эндобдж 284 0 объект > эндобдж 287 0 объект (11.3 Оптимальные компрессоры для класса источников. Резервирование.) эндобдж 288 0 объект > эндобдж 291 0 объект (11.4 * Приблизительное минимаксное решение: априор Джеффри) эндобдж 292 0 объект > эндобдж 295 0 объект (11.5 Последовательное вероятностное присвоение: Кричевский-Трофимов) эндобдж 296 0 объект > эндобдж 299 0 объект (11.6 Индивидуальная последовательность и универсальное предсказание) эндобдж 300 0 объект > эндобдж 303 0 объект (Компрессор 11.7 Lempel-Ziv) эндобдж 304 0 объект > эндобдж 307 0 объект (III Проверка бинарных гипотез) эндобдж 308 0 объект > эндобдж 311 0 объект (12 Проверка бинарных гипотез) эндобдж 312 0 объект > эндобдж 315 0 объект (12.1 Проверка двоичных гипотез) эндобдж 316 0 объект > эндобдж 319 0 объект (12.2 Формулировка Неймана-Пирсона) эндобдж 320 0 объект > эндобдж 323 0 объект (12.3 теста отношения правдоподобия) эндобдж 324 0 объект > эндобдж 327 0 объект (12.4 Обратные оценки на R \ (P, Q \)) эндобдж 328 0 объект > эндобдж 331 0 объект (12.5 Границы достижимости на R \ (P, Q \)) эндобдж 332 0 объект > эндобдж 335 0 объект (12.6 Асимптотика) эндобдж 336 0 объект > эндобдж 339 0 объект (13 Асимптотика проверки гипотез I) эндобдж 340 0 объект > эндобдж 343 0 объект (13.1 Режим Штейна) эндобдж 344 0 объект > эндобдж 347 0 объект (13.2 Режим Чернова) эндобдж 348 0 объект > эндобдж 351 0 объект (13.3 Основы теории больших уклонений) эндобдж 352 0 объект > эндобдж 355 0 объект (14 Информационная проекция и Большое отклонение) эндобдж 356 0 объект > эндобдж 359 0 объект (14.1 Показатели большого отклонения) эндобдж 360 0 объект > эндобдж 363 0 объект (14.2 Информационная проекция) эндобдж 364 0 объект > эндобдж 367 0 объект (14.3 Интерпретация информационной проекции) эндобдж 368 0 объект > эндобдж 371 0 объект (14.4 Обобщение: теорема Санова) эндобдж 372 0 объект > эндобдж 375 0 объект (15 Асимптотика проверки гипотез II) эндобдж 376 0 объект > эндобдж 379 0 объект (15.1 \ (E0, E1 \) — Компромисс) эндобдж 380 0 объект > эндобдж 383 0 объект (15.2 Эквивалентные формы теоремы 15.1) эндобдж 384 0 объект > эндобдж 387 0 объект (15.3 * Последовательная проверка гипотез) эндобдж 388 0 объект > эндобдж 391 0 объект (Кодирование IV канала) эндобдж 392 0 объект > эндобдж 395 0 объект (16-канальное кодирование) эндобдж 396 0 объект > эндобдж 399 0 объект (16.1 Канальное кодирование) эндобдж 400 0 объект > эндобдж 403 0 объект (16.2 Основные результаты) эндобдж 404 0 объект > эндобдж 407 0 объект (16.3 Общие \ (слабые \) обратные границы) эндобдж 408 0 объект > эндобдж 411 0 объект (16.4 Общие границы достижимости: предварительный просмотр) эндобдж 412 0 объект > эндобдж 415 0 объект (17-канальное кодирование: границы достижимости) эндобдж 416 0 объект > эндобдж 419 0 объект (17.1 Плотность информации) эндобдж 420 0 объект > эндобдж 423 0 объект (17,2 Граница достижимости Шеннона) эндобдж 424 0 объект > эндобдж 427 0 объект (17.3 Граница проверки зависимости) эндобдж 428 0 объект > эндобдж 431 0 объект (17.4 Лемма Файнштейна) эндобдж 432 0 объект > эндобдж 435 0 объект (18 линейных кодов. Емкость канала) эндобдж 436 0 объект > эндобдж 439 0 объект (18.1 Линейное кодирование) эндобдж 440 0 объект > эндобдж 443 0 объект (18,2 каналов и пропускная способность) эндобдж 444 0 объект > эндобдж 447 0 объект (18,3 границы для C; пропускная способность стационарных каналов без памяти) эндобдж 448 0 объект > эндобдж 451 0 объект (18.4 Примеры DMC) эндобдж 452 0 объект > эндобдж 455 0 объект (18.5 * Информационная стабильность) эндобдж 456 0 объект > эндобдж 459 0 объект (19 каналов с входными ограничениями. Гауссовы каналы.) эндобдж 460 0 объект > эндобдж 463 0 объект (19.1 Кодирование каналов с ограничениями ввода) эндобдж 464 0 объект > эндобдж 467 0 объект (19.2 Емкость при входном ограничении C \ (P \) =? Ci \ (P \)) эндобдж 468 0 объект > эндобдж 471 0 объект (19.3 Приложения) эндобдж 472 0 объект > эндобдж 475 0 объект (19,4 * Нестационарный AWGN) эндобдж 476 0 объект > эндобдж 479 0 объект (19.5 * стационарный аддитивный цветной канал гауссовского шума) эндобдж 480 0 объект > эндобдж 483 0 объект (19.6 * Канал аддитивного белого гауссовского шума с межсимвольной интерференцией) эндобдж 484 0 объект > эндобдж 487 0 объект (19,7 * гауссовские каналы с ограничениями по амплитуде) эндобдж 488 0 объект > эндобдж 491 0 объект (19,8 * гауссовские каналы с затуханием) эндобдж 492 0 объект > эндобдж 495 0 объект (20 решеточных кодов \ (по О. Ордентлиху \)) эндобдж 496 0 объект > эндобдж 499 0 объект (20.1 Определения решетки) эндобдж 500 0 объект > эндобдж 503 0 объект (20.2 Первая попытка увеличения пропускной способности AWGN) эндобдж 504 0 объект > эндобдж 507 0 объект (20.3 Вложенные решеточные коды / Созвездия Вороного) эндобдж 508 0 объект > эндобдж 511 0 объект (20.4 Кодирование грязной бумаги) эндобдж 512 0 объект > эндобдж 515 0 объект (20.5 Построение хороших пар вложенных решеток) эндобдж 516 0 объект > эндобдж 519 0 объект (21-канальное кодирование: энергия на бит, каналы с непрерывным временем) эндобдж 520 0 объект > эндобдж 523 0 объект (21,1 энергии на бит) эндобдж 524 0 объект > эндобдж 527 0 объект (21.2 Что такое N0?) эндобдж 528 0 объект > эндобдж 531 0 объект (21.3 Пропускная способность канала AWGN с непрерывным временным ограничением) эндобдж 532 0 объект > эндобдж 535 0 объект (21.4 Пропускная способность канала AWGN с непрерывным временем и неограниченной полосой частот) эндобдж 536 0 объект > эндобдж 539 0 объект (21,5 Емкость на единицу стоимости) эндобдж 540 0 объект > эндобдж 543 0 объект (22 Расширенное кодирование каналов. Разделение источника и канала.) эндобдж 544 0 объект > эндобдж 547 0 объект (22.1 Сильный Конверс) эндобдж 548 0 объект > эндобдж 551 0 объект (22.2 Стационарный канал без памяти без сильного разговора) эндобдж 552 0 объект > эндобдж 555 0 объект (22.3-канальная дисперсия) эндобдж 556 0 объект > эндобдж 559 0 объект (22,4 нормализованная скорость) эндобдж 560 0 объект > эндобдж 563 0 объект (22.5 Совместное кодирование исходного канала) эндобдж 564 0 объект > эндобдж 567 0 объект (23-канальное кодирование с обратной связью) эндобдж 568 0 объект > эндобдж 571 0 объект (23.1 Обратная связь не увеличивает пропускную способность для стационарных каналов без памяти) эндобдж 572 0 объект > эндобдж 575 0 объект (23.2 * Альтернативное доказательство теоремы 23.1 и направленной информации Месси) эндобдж 576 0 объект > эндобдж 579 0 объект (23.3 Когда обратная связь действительно полезна?) эндобдж 580 0 объект > эндобдж 583 0 объект (24 кода достижения емкости через конкатенацию Форни) эндобдж 584 0 объект > эндобдж 587 0 объект (24.1 Показатели ошибки) эндобдж 588 0 объект > эндобдж 591 0 объект (24.2 Достижение полиномиально малой вероятности ошибки) эндобдж 592 0 объект > эндобдж 595 0 объект (24.3 Составные коды) эндобдж 596 0 объект > эндобдж 599 0 объект (24.4 Достижение экспоненциально малой вероятности ошибки) эндобдж 600 0 объект > эндобдж 603 0 объект (V сжатие данных с потерями) эндобдж 604 0 объект > эндобдж 607 0 объект (25 Теория скоростных искажений) эндобдж 608 0 объект > эндобдж 611 0 объект (25.1 Скалярное квантование) эндобдж 612 0 объект > эндобдж 615 0 объект (25.2 Теоретико-информационное векторное квантование) эндобдж 616 0 объект > эндобдж 619 0 объект (25,3 * Преобразование избыточных искажений в среднее) эндобдж 620 0 объект > эндобдж 623 0 объект (26 Скоростное искажение: границы достижимости) эндобдж 624 0 объект > эндобдж 627 0 объект (26.1 Резюме) эндобдж 628 0 объект > эндобдж 631 0 объект (26.2 Теорема Шеннона скорость-искажение) эндобдж 632 0 объект > эндобдж 635 0 объект (26.3 * Лемма о покрытии) эндобдж 636 0 объект > эндобдж 639 0 объект (27 Оценка R \ (D \).Разделение источника и канала с потерями.) эндобдж 640 0 объект > эндобдж 643 0 объект (27.1 Оценка R \ (D \)) эндобдж 644 0 объект > эндобдж 647 0 объект (27.2 * Аналог свойства седловой точки в соотношении скорость-искажение) эндобдж 648 0 объект > эндобдж 651 0 объект (27.3 Совместное кодирование канала источника с потерями) эндобдж 652 0 объект > эндобдж 655 0 объект (27.4 Чего не хватает в классическом сжатии с потерями?) эндобдж 656 0 объект > эндобдж 659 0 объект (VI Расширенные темы) эндобдж 660 0 объект > эндобдж 663 0 объект (28 приложений к теории статистических решений) эндобдж 664 0 объект > эндобдж 667 0 объект (28.1 Fano, LeCam и минимаксные риски) эндобдж 668 0 объект > эндобдж 671 0 объект (28.2 Метод взаимной информации) эндобдж 672 0 объект > эндобдж 675 0 объект (29 каналов множественного доступа) эндобдж 676 0 объект > эндобдж 679 0 объект (29.1 Проблемная мотивация и основные результаты) эндобдж 680 0 объект > эндобдж 683 0 объект (29.2 Граница достижимости MAC) эндобдж 684 0 объект > эндобдж 687 0 объект (Подтверждение емкости 29,3 MAC) эндобдж 688 0 объект > эндобдж 691 0 объект (30 примеров MAC. Максимальная Pe и пропускная способность без ошибок.) эндобдж 692 0 объект > эндобдж 695 0 объект (30.1 Резюме) эндобдж 696 0 объект > эндобдж 699 0 объект (30.2 Ортогональный MAC) эндобдж 700 0 объект > эндобдж 703 0 объект (30,3 BSC MAC) эндобдж 704 0 объект > эндобдж 707 0 объект (30.4 MAC сумматора) эндобдж 708 0 объект > эндобдж 711 0 объект (30,5 множитель MAC) эндобдж 712 0 объект > эндобдж 715 0 объект (30,6 ПДК сокращения) эндобдж 716 0 объект > эндобдж 719 0 объект (30,7 гауссовского MAC) эндобдж 720 0 объект > эндобдж 723 0 объект (30.8 Особенности MAC) эндобдж 724 0 объект > эндобдж 727 0 объект (31 генератор случайных чисел) эндобдж 728 0 объект > эндобдж 731 0 объект (31.1 Настройка) эндобдж 732 0 объект > эндобдж 735 0 объект (31,2 конверс) эндобдж 736 0 объект > эндобдж 739 0 объект (Конструкция 31.3 Элиасом ГСЧ из компрессоров без потерь) эндобдж 740 0 объект > эндобдж 743 0 объект (31.4 Повторная схема Переса фон Неймана) эндобдж 744 0 объект > эндобдж 747 0 объект (31,5 фабрика Бернулли) эндобдж 748 0 объект > эндобдж 751 0 объект (31.6 Связанные проблемы) эндобдж 752 0 объект > эндобдж 755 0 объект (32 Энтропийный метод в комбинаторике и геометрии) эндобдж 756 0 объект > эндобдж 759 0 объект (32.ODjDMˉT $ ɒ | 1yvll:, x} 1? I \ & SN, {i55 (‘3E.7Y2P! «) NLEIHa ټ dk [) ۦ XS] sMʮ / U [Vʯ + lRB) 5IL $! + Әs8], 4 ڬ vtˮ’xQAFҠ, [ uY \ vQ! Ԏy1 LHOuv4Z $ g> R qPX $ U # $ `++ 8`M5 (LOa% sYlWT’w)> 6cZ +% d (OrV

Отказ от роста: обновление

1. Gahagen С. Неспособность развиваться: следствие недоедания. Педиатр Ред. . 2006; 27 (1): e1 – e11 ….

2. Леви Y, Леви А, Занген Т, и другие. Диагностические подсказки для выявления неорганических и органических причин отказа от пищи и плохого кормления. J Педиатр Gastroenterol Nutr . 2009. 48 (3): 355–362.

3. Панетта Ф, Magazzù D, Sferlazzas C, Ломбардо М, Magazzù G, Lucanto MC. Диагноз по положительной моде неорганической недостаточности развития. Акта Педиатр . 2008. 97 (9): 1281–1284.

4. Ольсен Е.М., Петерсен Дж, Сковгаард А.М., Вейле Б, Йоргенсен Т, Райт СМ. Неспособность развиваться: преобладание и совпадение антропометрических критериев в общей детской популяции. Арч Дис Детский . 2007. 92 (2): 109–114.

5. Неспособность развиваться. Краткое содержание критериев определения инвалидности младенцев и детей. Отчет о доказательствах / оценка технологии: № 72. Публикация AHRQ № 03-E019. Роквилл, штат Мэриленд: Агентство медицинских исследований и качества; Март 2003 г. http://www.ahrq.gov/clinic/epcsums/fthrivesum.htm. По состоянию на 6 января 2010 г.

6. de Onis M, Гарза С, Оньянго А.В., Борги Э. Сравнение стандартов роста детей ВОЗ и графиков роста CDC 2000. J Nutr . 2007. 137 (1): 144–148.

7. Olsen EM. Неспособность преуспеть: все еще проблема определения. Clin Pediatr (Phila) . 2006. 45 (1): 1–6.

8. Shah MD. Неспособность развиваться у детей. Дж Клин Гастроэнтерол . 2002. 35 (5): 371–374.

9. Bern C, Цукер-младший, Перкинс Б.А., Отиено Дж., Олоо Эй Джей, Ип Р. Оценка потенциальных показателей белково-энергетической недостаточности питания в алгоритме комплексного ведения детских болезней. Орган здоровья Bull World . 1997; 75 (приложение 1): 87–96.

10. Блок RW, Кребс Н.Ф .; Комитет Американской академии педиатрии по жестокому обращению с детьми и безнадзорности; Комитет по питанию Американской академии педиатрии. Неспособность развиваться как проявление детской пренебрежения. Педиатрия . 2005. 116 (5): 1234–1237.

11. Roche AF, Sun SS. Человеческий рост: оценка и интерпретация. Кембридж, Соединенное Королевство: Издательство Кембриджского университета; 2003 г.

12. Mei Z, Груммер-Строун Л.М., Томпсон Д., Dietz WH. Сдвиги в процентилях роста в раннем детстве: анализ продольных данных Калифорнийского исследования здоровья и развития детей. Педиатрия . 2004; 113 (6): e617 – e627.

13. Многоцентровая справочная исследовательская группа ВОЗ. Стандарты роста детей ВОЗ: скорость роста в зависимости от веса, длины и окружности головы: методы и разработка. Женева, Швейцария: Всемирная организация здравоохранения, Департамент питания для здоровья и развития; 2009 г.

14. Бергман П., Грэм Дж. Подход к «неспособности процветать». Врач Ост Фам . 2005. 34 (9): 725–729.

15. Ольсен Е.М., Сковгаард А.М., Вейле Б, Йоргенсен Т. Факторы риска неспособности развиваться в младенчестве зависят от используемых антропометрических определений: детской когорты округа Копенгаген. Педиатр Перинат Эпидемиол . 2007. 21 (5): 418–431.

16. Гахаган С., Холмс Р. Поэтапный подход к оценке недостаточности питания и неспособности к развитию. Педиатрическая клиника North Am . 1998. 45 (1): 169–187.

17. Даниэль М., Kleis L, Cemeroglu AP. Этиология нарушения развития у младенцев и детей ясельного возраста направлена ​​в амбулаторную педиатрическую эндокринологию. Clin Pediatr (Phila) . 2008. 47 (8): 762–765.

18. Schwartz ID. Неспособность преуспеть: старый враг нового тысячелетия. Педиатр Ред. . 2000. 21 (8): 257–264.

19. Эмонд А, Дрюетт Р., Блэр П., Эммет П.Постнатальные факторы, связанные с неспособностью к развитию доношенных новорожденных, в лонгитюдном исследовании Avon для родителей и детей. Арч Дис Детский . 2007. 92 (2): 115–119.

20. Стивенс МБ, Джентри BC, Миченер MD, Кендалл СК, Гауэр Р. Клинические исследования. Какое клиническое обследование при неудаче в развитии? J Fam Pract . 2008. 57 (4): 264–266.

21. Райт К.М., Паркинсон К.Н., Дрюетт РФ.Как кормление матери и ребенка связано с набором веса и неспособностью нормально развиваться? Данные из когорты предполагаемых рождений. Педиатрия . 2006. 117 (4): 1262–1269.

22. Бар-Зохар Д, Сегал-Альгранати Д, Белсон А, Рейф С. Диагностика кистозного фиброза – астмы и неспособность нормально развиваться как показания для пробы пота. J Med . 2004. 35 (1–6): 93–103.

23. Ficicioglu C, Ан Хаак К. Неспособность развиваться: когда подозревать врожденные нарушения обмена веществ. Педиатрия . 2009; 124 (3): 972–979.

24. Райт К.М., Паркинсон К.Н., Дрюетт РФ. Влияние материнских социально-экономических и эмоциональных факторов на прибавку в весе и снижение веса младенца (неспособность развиваться): данные из когорты предполагаемых рождений. Арч Дис Детский . 2006. 91 (4): 312–317.

25. Montagnoli LC, Барбьери М.А., Беттиол Н, Маркес Иллинойс, де Соуза Л. Нарушение роста у детей с различными типами расщелины губ и неба в первые два года жизни: кросс-секционное исследование. Дж. Педиатр (Рио Дж.) . 2005. 81 (6): 461–465.

26. Фостер Б.Дж., Леонард МБ. Питание у детей с заболеванием почек: подводные камни популярных методов оценки. Perit Dial Int . 2005; 25 (приложение 3): S143 – S146.

27. McDougall P, Дрюетт РФ, Хунгин А.П., Райт СМ. Выявление раннего снижения веса на 6–8-недельной проверке и его связь с семейными факторами, кормлением и поведенческим развитием. Арч Дис Детский . 2009. 94 (7): 549–552.

28. Райт CM. Выявление неудач и управление ими: точка зрения сообщества. Арч Дис Детский . 2000. 82 (1): 5–9.

29. Камень RS, Spiegel JH. Распространенность обструктивного нарушения сна у детей с задержкой развития. J Otolaryngol Head Neck Surg . 2009. 38 (5): 573–579.

30. Кареага МГ, Кернер Дж. А. Младший Подход гастроэнтеролога к отказу от роста [опубликованная поправка опубликована в Pediatr Ann.2000; 29 (12): 742]. Педиатр Энн . 2000. 29 (9): 558–567.

31. Хрен I, Mis NF, Бречель Дж, и другие. Влияние добавок молочной смеси на грудных детей с задержкой развития. Педиатр Инт . 2009. 51 (3): 346–351.

32. Хошу В, Райфен Р. Использование высококалорийной смеси для лечения младенцев с неорганической недостаточностью развития. Eur J Clin Nutr . 2002. 56 (9): 921–924.

33.Кларк С.Е., Эванс С, Макдональд А, Дэвис П., Бут IW. Рандомизированное сравнение смеси с высоким содержанием питательных веществ и смеси с энергетическими добавками для младенцев с задержкой роста. J Hum Nutr Diet . 2007. 20 (4): 329–339.

34. Райт К.М., Паркинсон К.Н., Шиптон Д, Дрюетт РФ. Как проблемы с питанием малышей связаны с их пищевым поведением, пищевыми предпочтениями и ростом? Педиатрия . 2007; 120 (4): e1069 – e1075.

35. Смит М.М., Лифшиц Ф. Чрезмерное потребление фруктового сока как фактор, способствующий нарушению роста неорганических веществ. Педиатрия . 1994. 93 (3): 438–443.

36. Кендрик Д., Элькан Р, Хьюитт М, и другие. Улучшает ли посещение на дому воспитание детей и качество домашней обстановки? Систематический обзор и мета-анализ. Арч Дис Детский . 2000. 82 (6): 443–451.

37. Черный ММ, Дубовиц H, Кришнакумар А, Старр Р. Х. мл.Раннее вмешательство и выздоровление среди детей с задержкой развития: наблюдение в возрасте 8 лет. Педиатрия . 2007. 120 (1): 59–69.

38. Sandberg DE. Следует ли лечить невысоких детей, у которых нет дефицита гормона роста? Вест Дж. Мед. . 2000. 172 (3): 186–189.

39. Кулурис М, Майер Дж. Л., Фрейер Д.Р., Сандлер Э, Сюй П, Krischer JP. Влияние гидрохлорида ципрогептадина (периактин) и мегестрола ацетата (мегестерол) на вес у детей с раком / кахексией, связанной с лечением. J Педиатр Hematol Oncol . 2008. 30 (11): 791–797.

40. Рудольф М.К., Логан С. Каков долгосрочный результат для детей, которые не могут развиваться? Систематический обзор. Арч Дис Детский . 2005. 90 (9): 925–931.

41. Waterflow JC. Некоторые аспекты детского недоедания как проблема общественного здравоохранения. Br Med J . 1974; 4 (5936): 88–90.

Джеффри С. Гербер, доктор медицинских наук

Статьи

2019

Gmuca S, Xiao R, Urquhart A, Weiss PF, Gillham JE, Ginsburg KR, Sherry DD, Gerber JS: Роль устойчивости пациентов и родителей у подростков с хронической скелетно-мышечной болью.J Pediatr 210: 118-126.e2, июл 2019 Примечания: Epub 2019 10 апр.

Ramchandar N, Gierhart S, Creppage KE, Chukwuma U, Gerber JS, Arnold J, Milder E: Эпидемиология серьезных бактериальных инфекций у младенцев в возрасте до 90 дней в когорте военной системы здравоохранения. Pediatr Infect Dis J 17 июня 2019 г.

Хиотос К., Тамма П.Д., Гербер Дж.С.: Использование антибиотиков в отделении интенсивной терапии: проблемы и возможности. Infect Control Hosp Epidemiol 40 (6): 693-698, июнь 2019 Примечания: Epub 2019, 3 мая.

Szymczak JE, Kitt E, Hayes M, Chiotos K, Coffin SE, Schriver ER, Patton AM, Metjian TA, Gerber JS: Угрожающая эффективность, а не автономия: Восприятие создателями установленной программы контроля над противомикробными препаратами у детей. Infect Control Hosp Epidemiol 40 (5): 522-527, май 2019 Примечания: Epub 2019 28 марта

Флорин Т.А., Бычковски Т., Гербер Дж. С., Радди Р., Купперманн Н.: Диагностическое тестирование и использование антибиотиков у маленьких детей с внебольничной пневмонией в США, 2008-2015 гг.J Pediatric Infect Dis Soc 20 мая 2019 г. Примечания: EPub перед печатью.

Hamdy RF, Handy LK, Spyridakis E, Dona D, Bryan M, Collins JL, Gerber JS: сравнительная эффективность цефтриаксона плюс метронидазол по сравнению с антипсевдомонадными антибиотиками при перфорированном аппендиците у детей. Surg Infect (Larchmt) 15 марта 2019 г. Примечания: [Epub перед печатью]

Hamdy RF, Dona D, Jacobs MB, Gerber JS: Факторы риска осложнений у детей с бактериемией Staphylococcus aureus. J Pediatr Страница: pii: S0022-3476 (18) 31719-0, 14 марта 2019 г. Примечания: [Epub перед печатью]

Tribble AC, Росс Р.К., Гербер Дж.С.: Сравнение назначения антибиотиков при педиатрической внебольничной пневмонии в детских и недетских больницах.Педиатрия JAMA 173 (2): 190-192, февраль 2019 г.

Gerber JS, Росс RK, Szymczak JE, Xiao R, Localio AR, Grundmeier RW, Rettig SL, Teszner E, Canning DA, Coffin SE: Инфекции после детской амбулаторной хирургии: заболеваемость и факторы риска. Инфекционный контроль и больничная эпидемиология 40 (2): 150-157, февраль 2019 г.

Frost HM, Gerber JS, Hersh AL: Рекомендации по антибиотикам при остром среднем отите и остром бактериальном синусите. Pediatr Infect Dis J 38 (2): 217, февраль 2019 г.

2018

Spaulding AB, Thurm C, Courter JD, Banerjee R, Gerber JS, Newland JG, Parker SK, Brogan TV, Kronman MP, Shah SS, Smith MJ, Patel SJ, Lee BR, Hersh AL: Эпидемиология инфекций Staphylococcus aureus у пациентов госпитализирован в отдельно стоящие детские больницы, 2009-2016 гг.Инфекционный контроль и госпитальная эпидемиология 39 (12): 1487-1490, декабрь 2018 г.

Smith MJ, Thurm C, Shah SS, Patel SJ, Kronman MP, Gerber JS, Courter JD, Lee BR, Newland JG, Hersh AL: Путь введения антибиотиков с высокой пероральной биодоступностью. Инфекционный контроль и больничная эпидемиология Страница: 1-2, декабрь 2018 г.

Hsu Alice J, Hamdy Rana F, Huang Yanjie, Olson Jared A, Ghobrial Shahira, Gerber Jeffrey S, Hersh Adam L, Tamma Pranita D: Ассоциация между минимальными концентрациями ванкомицина и продолжительностью действия метициллин-устойчивой бактериемии Staphylococcus aureus у детей.Журнал Общества детских инфекционных болезней 7 (4): 338-341, декабрь 2018 г.

Даунс К.Дж., Фицджеральд Дж. К., Шрайвер Э., Боге ЦЛК, Руссо М.Э., Вайс С.Л., Баламут Ф., Кубис С.Е., Толомео П., Билкер В.Б., Хан Дж.Х., Лаутенбах Е., Коффин С.Е., Гербер Дж.С. Алгоритм использования антибиотиков в педиатрическом отделении интенсивной терапии: исследование стратегии оптимизации антибиотиков при сепсисе (OASIS) II. Журнал Общества детских инфекционных болезней, ноябрь 2018 г.

Karavite DJ, Miller MW, Ramos MJ, Rettig SL, Ross RK, Xiao R, Muthu N, Localio AR, Gerber JS, Coffin SE, Grundmeier RW: пользовательское тестирование инструмента для сбора информации для амбулаторного хирургического надзора за инфекциями.Прикладная клиническая информатика 9 (4): 791-802, октябрь 2018 г.

Grundmeier RW, Xiao R, Ross RK, Ramos MJ, Karavite DJ, Michel JJ, Gerber JS, Coffin SE: Выявление инфекций в области хирургического вмешательства в электронных данных о состоянии здоровья с использованием прогнозных моделей. Журнал Американской ассоциации медицинской информатики: JAMIA 25 (9): 1160-1166, сентябрь 2018 г.

Kelly BJ, Lautenbach E, Nachamkin I, Coffin SE, Gerber JS, Fuchs BD, Garrigan C, Han X, Bilker WB, Wise J, Tolomeo P, Han JH: комбинированные биомаркеры предсказывают острую смертность среди тяжелобольных пациентов с подозрением на сепсис.Реанимация 46 (7): 1106-1113, июль 2018 г.

Elgarten CW, Arnold SD, Li Y, Huang Y-SV, Riches ML, Gerber JS, Aplenc R, Saber W, Fisher BT: Изменчивость на уровне больниц в применении антибиотиков широкого спектра действия для детей с острым лейкозом, подвергающихся трансплантации гемопоэтических клеток. Инфекционный контроль и госпитальная эпидемиология 39 (7): 797-805, июль 2018 г.

Tasian GE, Jemielita T, Goldfarb DS, Copelovitch L, Gerber JS, Wu Q, Denburg MR: Устное воздействие антибиотиков и почечнокаменная болезнь.Журнал Американского общества нефрологов 29 (6): 1731-1740, июнь 2018 г.

Gmuca S, Xiao R, Weiss PF, Sherry DD, Knight AM, Gerber JS: Назначение опиоидов и полипрагмазия у детей с хронической скелетно-мышечной болью. Лекарство от боли 20 (3): 495-503, июнь 2018 г.

Flannery DD, Ross RK, Mukhopadhyay S, Tribble AC, Puopolo KM, Gerber JS: Temporal Trends and Center Variation in Early Antibiotic Use Среди недоношенных детей. Открытие сети JAMA 1 (1): e180164, май 2018 г.

Spyridakis E, Gerber JS, Schriver E, Grundmeier RW, Porsch EA, St Geme JW, Downes KJ: Клинические особенности и исходы у детей с культурально-отрицательным септическим артритом.Журнал Общества детских инфекционных болезней, апрель 2018 г.

Gmuca S, Xiao R, Weiss PF, Waldman AT, Gerber JS: Использование ритуксимаба и риск повторной госпитализации для детей с расстройством оптического спектра нейромиелита. Рассеянный склероз и демиелинизирующие заболевания 3 апреля 2018 г.

Brogan TV, Thurm C, Hersh AL, Gerber JS, Smith MJ, Shah SS, Courter JD, Patel SJ, Parker SK, Kronman MP, Lee BR, Newland JG: Различия в использовании антибиотиков в разных отделениях интенсивной терапии интенсивной терапии. Педиатрическая реанимация, март 2018.

Росс Р.К., Кил Л., Кубис С., Лаутц А.Дж., Дзиорни А.К., Денсон А.Р., О’Коннор К.А., Чилутти М.Р., Вайс С.Л., Гербер Дж.С.: Влияние анализа на прокальцитонин на использование антибиотиков у детей в критическом состоянии. Журнал Общества детских инфекционных болезней, февраль 2018 г.

Gaw CE, Гамильтон KW, Гербер JS, Szymczak JE: Восприятие врачей относительно использования противомикробных препаратов при уходе за пациентами в конце жизни. Эпизод по инфекционному контролю и больничной эпидемиологии перед печатью, 12 февраля 2018 г.

Симпао А.Ф., Ахумада Л.М., Ларру Мартинес Б., Карденас А.М., Метджиан Т.А., Салливан К.В., Гальвес Дж.А., Десаи Б.Р., Рехман М.А., Гербер Дж.С.: Разработка и внедрение электронной антибиотикограммы с визуальной аналитикой в ​​электронной системе медицинской карты в третичном учреждении Детская больница.Прикладная клиническая информатика 9 (1): 37-45, январь 2018 г.

McPherson C, Lee BR, Terrill C, Hersh AL, Gerber JS, Kronman MP, Newland JG: Характеристики программ контроля над антимикробными препаратами в педиатрии: текущее состояние совместного использования отчетов об антимикробных препаратах для контроля над педиатрией (SHARPS). Antibiotics (Базель, Швейцария) 7 (1), январь 2018 г.

2017

Lewis-de Los Angeles WW, Thurm C, Hersh AL, Shah SS, Smith MJ, Gerber JS, Parker SK, Newland JG, Kronman MP, Lee BR, Brogan TV, Courter JD, Spaulding A, Patel SJ: Trends in Intravenous Продолжительность приема антибиотиков при инфекциях мочевыводящих путей у младенцев.Педиатрия 140 (6), декабрь 2017 г.

Kronman MP, Banerjee R, Duchon J, Gerber JS, Green MD, Hersh AL, Hyun D, ​​Maples H, Nash CB, Parker S, Patel SJ, Saiman L, Tamma PD, Newland JG: Расширение существующих программ контроля над антимикробными препаратами в педиатрии : Что будет дальше. Журнал Общества детских инфекционных болезней, декабрь 2017 г.

Гербер Дж. С., Росс Р. К., Брайан М., Локалио А. Р., Шимчак Дж. Э., Вассерман Р., Баркман Д., Одений Ф., Конабой К., Белл Л., Заутис Т. Е., Фикс А. Г.: Ассоциация антибиотиков широкого и узкого спектра действия при неэффективности лечения, Неблагоприятные события и качество жизни у детей с острыми инфекциями дыхательных путей.JAMA 318 (23): 2325-2336, 12 2017.

Гоял М.К., Джонсон Т.Дж., Чемберлен Д.М., Каспер Т.К., Симмонс Т., Алессандрини Е.А., Баджадж Л., Грундмайер Р.В., Гербер Дж.С., Лорч С.А., Альперн ЭР; Сеть прикладных исследований педиатрической помощи (PECARN): Расовые и этнические различия в использовании антибиотиков для лечения вирусных заболеваний в отделениях неотложной помощи. Педиатрия. 140 (4), октябрь 2017 г.

Blyth CC, Gerber JS .: Макролиды у детей с внебольничной пневмонией: панацея или плацебо? J Pediatric Infect Dis Soc. Epub перед печатью (1): 71-77, 31 октября 2017 г.

Шимчак Дж. Э., Клигер С. Б., Миллер М., Фикс А. Г., Гербер Дж. С.: Что родители думают о рисках и преимуществах антибиотиков при острой инфекции дыхательных путей их детей. J Pediatric Infect Dis Soc. Epub в преддверии печати, 14 сентября 2017 г.

Neuman MI, Hall M, Lipsett SC, Hersh AL, Williams DJ, Gerber JS, Brogan TV, Blaschke AJ, Grijalva CG, Parikh K, Ambroggio L, Shah SS; Педиатрические исследования в сети стационаров: полезность посева крови среди детей, госпитализированных с внебольничной пневмонией.Педиатрия 140 (3), сентябрь 2017 г.

Hsu AJ, Hamdy RF, Huang Y, Olson JA, Ghobrial S, Gerber JS, Hersh AL, Tamma PD: Ассоциация между минимальными концентрациями ванкомицина и продолжительностью бактериемии у детей, устойчивой к метициллину Staphylococcus aureus. J Pediatric Infect Dis Soc. Epub в преддверии печати, 14 сентября 2017 г.

Gerber JS, Hersh AL, Kronman MP, Newland JG, Ross RK, Metjian TA: Разработка и применение индекса спектра антибиотиков для сравнительного анализа моделей выбора антибиотиков в больницах.Инфекционный контроль и больничная эпидемиология 38 (8): 993-997, август 2017 г.

Courter JD, Parker SK, Thurm C, Kronman MP, Weissman SJ, Shah SS, Hersh AL, Brogan TV, Patel S, Smith MJ, Lee BR, Newland JG, Gerber JS: Точность административных данных для применения противомикробных препаратов в госпитализированных Дети. J Pediatric Infect Dis Soc. Перед печатью Epub, 18 августа 2017 г.

Basiaga ML, Ross ME, Gerber JS, Ogdie A: Заболеваемость Pneumocystis jirovecii и побочные эффекты, связанные с профилактикой пневмоцистоза, у детей, получающих глюкокортикоиды.Журнал Общества детских инфекционных болезней, июль 2017 г.

Goldman JL, Ross RK, Lee BR, Newland JG, Hersh AL, Kronman MP, Gerber JS: изменчивость использования противогрибковых и противовирусных препаратов у госпитализированных детей. Инфекционный контроль и больничная эпидемиология 38 (6): 743-746, июнь 2017 г.

Hamdy RF, Hsu AJ, Stockmann C, Olson JA, Bryan M, Hersh AL, Tamma PD, Gerber JS: Эпидемиология устойчивой к метициллину бактериемии Staphylococcus aureus у детей. Педиатрия Май 2017 Примечания: Epub опережает печать.

Williams DJ Hall M, Гербер JS, Neuman MI, Hersh AL, Brogan TV, Parikh K, Mahant S1, Blaschke AJ, Shah SS, Grijalva CG; Педиатрические исследования в сети стационаров: влияние национального руководства по выбору антибиотиков при госпитализированной пневмонии. Педиатрия 139 (4): e20163231, апр 2017.

Ньюленд Дж. Г., Гербер Дж. С., Кронман М. П., Мередит Дж., Ли Б. Р., Турм С., Херш А. Л.; Совместная работа SHARPS: Совместное использование отчетов о противомикробных препаратах для контроля над педиатрической помощью (SHARPS): совместная работа по повышению качества.J Pediatric Infect Dis Soc. 4 апреля 2017 г. Примечания: doi: 10.1093 / jpids / pix020. [Epub перед печатью]

Mistry RD, Newland JG, Gerber JS, Hersh AL, May L, Perman SM, Kuppermann N, Dayan PS: Текущее состояние управления антимикробными препаратами в отделениях неотложной помощи детской больницы. Инфекционный контроль и больничная эпидемиология 38 (4): 469-475, апрель 2017 г.

Weiss SL, Keele L, Balamuth F, Vendetti N, Ross R, Fitzgerald JC, Gerber JS: Выбор кристаллоидной жидкости и клинические результаты при детском сепсисе: согласованное ретроспективное когортное исследование.Педиатрический журнал 182: 304-310, март 2017 г.

Handy LK, Bryan M, Gerber JS, Zaoutis T, Feemster KA: изменчивость назначения антибиотиков для внебольничной пневмонии. Педиатрия 139 (4): e20162331, март 2017.

Goldman JL, Richardson T, Newland JG, Lee B, Gerber JS, Hall M, Kronman M, Hersh AL: Амбулаторная парентеральная антимикробная терапия у детей, зачисленных в Medicaid. Журнал Общества детских инфекционных болезней 6 (1): 65-71, март 2017 г.

Хиотос К., Росс Р.К., Хан Дж. Х., Миллер М., Гербер Дж. С.: Использование карбапенемов, полимиксинов и тигециклина в детских больницах США, 2010-2014 гг.Открытый форум Infect Dis. 4 (2): ofx039, март 2017 г.

Cluzet VC, Gerber JS, Nachamkin I, Coffin SE, Davis MF, Julian KG, Zaoutis TE, Metlay JP, Linkin DR, Tolomeo P, Wise JA, Bilker WB, Hu B, Lautenbach E: Факторы, связанные со стойкой колонизацией метициллином -резистентный золотистый стафилококк. Страница «Эпидемиология и инфекция»: 1–9, февраль 2017 г.

2016

Lautz AJ, Dziorny AC, Denson AR, O’Connor KA, Chilutti MR, Ross RK, Gerber JS, Weiss SL: Значение измерения прокальцитонина для ранних признаков тяжелых бактериальных инфекций в отделении детской интенсивной терапии.Педиатрический журнал 179: 74-81, декабрь 2016 г.

Ларру Б., Сулиман С.Е., Localio R, Росс Р.К., Шарланд М., Заутис Т.Е., Гербер Дж.С.: Знание врача первой линии о назначении противомикробных препаратов в академической третичной детской больнице: исследование точечной распространенности. Журнал Общества детских инфекционных болезней 5 (4): 462-464, декабрь 2016 г.

Drees M, Gerber JS, Morgan DJ, Lee GM: Методы исследования в области эпидемиологии здравоохранения и управления антимикробными препаратами: использование административных баз данных и баз данных эпиднадзора.Инфекционный контроль и больничная эпидемиология 37 (11): 1278-1287, ноябрь 2016 г.

Веларде А., Гербер Дж. С., Леонард М. Б., Се Д., Шиннар Р., Стром Б. Л.: Дети с инфекциями нижних дыхательных путей и уровнями 25-гидроксивитамина D3 в сыворотке: исследование случай-контроль. Детская пульмонология 51 (10): 1080-1087, октябрь 2016 г.

Cluzet VC, Gerber JS, Metlay JP, Nachamkin I, Zaoutis TE, Davis MF, Julian KG, Linkin DR, Coffin SE, Margolis DJ, Hollander JE, Bilker WB, Han X, Mistry RD, Gavin LJ, Tolomeo P, Wise JA, Уиллер М.К., Ху Б., Фишман Н.О., Ройер Д., Лаутенбах Э; Программа CDC Prevention Epicenters.: Влияние полной деколонизации домашнего хозяйства на устранение колонизации метициллин-резистентным золотистым стафилококком. Инфекционный контроль и больничная эпидемиология 37 (10): 1226-33, октябрь 2016 г.

Росс Р.К., Беус Дж. М., Метджиан Т.А., Локалио А.Р., Шелов Е.Д., Десаи Б.Р., О’Нил С.П., Заутис Т.Е., Гербер Дж.С. Инфекционный контроль и больничная эпидемиология 37 (8): 974-8, август 2016 г.

Захария П., Ньюленд Дж. Г., Гербер Дж. С., Сайман Л., Голдман Дж. Л., Херш А. Л.: Затраты на программы управления противомикробными препаратами в детских больницах США.Инфекционный контроль и больничная эпидемиология 37 (7): 852-4, июль 2016 г.

Миллер М.В., Росс Р.К., Войт С., Брауэр Х., Каравите Д.Д., Гербер Дж.С., Грундмайер Р.В., Гроб С.Е .: Цифровые изображения, созданные пациентами после детской амбулаторной хирургии. Прикладная клиническая информатика 7 (3): 646-52, 6 июля 2016 г.

Кронман М.П., ​​Орон А.П., Росс Р.К., Херш А.Л., Ньюленд Дж.Г., Голдин А., Рангель С.Дж., Вайсман С.Дж., Зерр Д.М., Гербер Дж.С.: Антибиотики расширенного спектра по сравнению с антибиотиками более узкого спектра при аппендиците. Педиатрия 138 (1): e20154547, июль 2016 г.

Himebauch AS, Sankar WN, Flynn JM, Sisko MT, Moorthy GS, Gerber JS, Zuppa AF, Fox E, Dormans JP, Kilbaugh TJ: Концентрации цефазолина в скелетных мышцах и плазме крови во время сложной детской хирургии позвоночника. Британский журнал анестезии 117 (1): 87-94, июль 2016 г.

Vendetti N, Gerber JS, Sammons JS, Fisher BT, Zaoutis TE, Coffin SE: прием паливизумаба в отделении интенсивной терапии. Госпитальная педиатрия 6 (6): 354-8, июнь 2016 г.

Downes KJ, Weiss SL, Gerber JS, Klieger SB, Fitzgerald JC, Balamuth F, Kubis SE, Tolomeo P, Bilker WB, Han X, Nachamkin I, Garrigan C, Han JH, Lautenbach E, Coffin SE: прагматичный биомаркер- Управляемый алгоритм для руководства использованием антибиотиков в педиатрическом отделении интенсивной терапии: исследование оптимизации антибиотиков при сепсисе (OASIS).Журнал Общества педиатрических инфекционных болезней Epub перед печатью (6 (2)): 134-141, 1 июня 2016 г.

Parikh K, Hall M, Blaschke AJ, Grijalva CG, Brogan TV, Neuman MI, Williams DJ, Gerber JS, Hersh AL, Shah SS: совокупное и больничное влияние национальных руководств по использованию диагностических ресурсов для детей с пневмонией у детей больницы. Журнал госпитальной медицины 11 (5): 317-23, май 2016 г.

Ларру Б., Гонг В., Вендетти Н., Салливан К. В., Локалио Р., Заутис Т. Е., Гербер Дж. С.: Инфекции кровотока у госпитализированных детей: эпидемиология и чувствительность к противомикробным препаратам.Журнал детских инфекционных болезней 35 (5): 507-10, май 2016 г.

Kelly BJ, Lautenbach E, Nachamkin I, Coffin SE, Gerber JS, Fuchs BD, Garrigan C, Han X, Bilker WB, Wise J, Tolomeo P, Han JH: Комбинированные биомаркеры определяют низкую вероятность бактериальной инфекции среди хирургических отделений интенсивной терапии пациенты отделения с подозрением на сепсис. Диагностическая микробиология и инфекционные заболевания 85 (1): 109-15, май 2016 г.

Fleming-Dutra KE, Hersh AL, Shapiro DJ, Bartoces M, Enns EA, File TM, Finkelstein JA, Gerber JS, Hyun DY, Linder JA, Lynfield R, Margolis DJ, May LS, Merenstein D, Metlay JP, Newland JG , Пичцирилло Дж. Ф., Робертс Р. М., Санчес Г. В., Суда К. Дж., Томас А., Ву Т. М., Зеттс Р. М., Хикс Л. А.: Распространенность несоответствующих рецептов антибиотиков среди амбулаторных посещений в США, 2010-2011 гг.JAMA 315 (17): 1864-73, май 2016 г.

Wolf J, Sun Y, Tang L, Newland JG, Gerber JS, Van Dyke CJ, Hymes SR, Yu D, Carias DC, Bryant PA: Антимикробные барьеры и цели в детской онкологии и трансплантации костного мозга: исследование контроля над антимикробными препаратами Практикующие. Инфекционный контроль и больничная эпидемиология 37 (3): 343-7, март 2016 г.

Stevens VW, Thurm C, Schwab EM, Kronman MP, Gerber JS, Shah SS, Newland JG, Courter J, Parker S, Brogan TV, Hersh AL: Использование сопутствующих антибиотиков во время лечения инфекции Clostridium difficile (CDI) у педиатрических стационаров : Наблюдательное когортное исследование.Инфекционные болезни и терапия 5 (1): 45-51, март 2016 г.

Гербер Дж. С., Брайан М., Росс Р. К., Деймонт С., Паркс Е. П., Локалио А. Р., Грундмайер Р. В., Сталлингс В. А., Заутис Т. Е.: Воздействие антибиотиков в течение первых 6 месяцев жизни и увеличение веса в детстве. JAMA 315 (12): 1258-65, 22-29 марта 2016 г.

Наяр Вайдехи, Кеннеди Андреа, Паппас Джанин, Этчли Криста Д., Филд Синтия, Сматерс Сара, Теснер Ева Э, Саммонс Джулия С., Гроб Сьюзан Э, Гербер Джеффри С., Спрей Томас Л., Стивен Джеймс М., Белл Луи М., Форрер Джоан , Гонсалес Фернандо, Чи Альберт, Нечпиль Уильям Дж., Мартин Джон Н., Гейнор Дж. Уильям: Улучшение отчетности и профилактики кардиохирургических инфекций путем использования данных реестра для установления случая.Анналы торакальной хирургии 101 (1): 190-8, январь 2016 г.

2015

Шиллинг Саманта, Сэмюэлс-Калоу Маргарет, Гербер Джеффри С., Скрибано Филип V, Френч Бенджамин, Вуд Джоан Н.: Тестирование и лечение после сексуального насилия в подростковом возрасте в педиатрических отделениях неотложной помощи. Педиатрия 136 (6): e1495-503, декабрь 2015 г.

Кронман Мэтью П., Херш Адам Л., Гербер Джеффри С., Росс Рэйчел К., Ньюленд Джейсон Дж., Голдин Адам, Рэнджел Шон Дж., Орон Ассаф П., Зерр Даниэль М.: Определение целей управления противомикробными препаратами для педиатрических хирургических пациентов.Журнал Общества педиатрических инфекционных болезней 4 (4): e100-8, декабрь 2015 г.

Gerber JS, Prasad PA, Localio RA, Fiks AG, Grundmeier RW, Bell LM, Wasserman RC, Keren R, Zaoutis TE: Различия в назначении антибиотиков в сети первичной педиатрической помощи. Журнал Общества детских инфекционных болезней 4 (4): 297-304, декабрь 2015 г.

Росс Р.К., Херш А.Л., Кронман М.П., ​​Ньюленд Дж. Г., Гербер Дж. С.: Стоимость антимикробной терапии в детских больницах США. Инфекционный контроль и больничная эпидемиология 36 (10): 1242-4, октябрь 2015 г.

Han Jennifer H, Nachamkin Irving, Coffin Susan E, Gerber Jeffrey S, Fuchs Barry, Garrigan Charles, Han Xiaoyan, Bilker Warren B., Wise Jacqueleen, Tolomeo Pam, Lautenbach Ebbing: использование алгоритма комбинированного биомаркера для определения отделения интенсивной терапии Пациенты с подозрением на сепсис с очень низкой вероятностью бактериальной инфекции. Противомикробные препараты и химиотерапия 59 (10): 6494-500, октябрь 2015 г.

Курлаба Г., Куркуни Э., Спиридис Н., Гербер Дж. С., Копсидас Дж., Мугку К., Лурида А., Заутис Т.Э .: Назначение антибиотиков и их расходы в амбулаторной педиатрии в Греции, 2010-13.Журнал антимикробной химиотерапии 70 (8): 2405-8, август 2015 г.

Cluzet VC, Gerber JS, Nachamkin I, Metlay JP, Zaoutis TE, Davis MF, Julian KG, Linkin DR, Coffin SE, Margolis DJ, Hollander JE, Bilker WB, Han X, Mistry RD, Gavin LJ, Tolomeo P, Wise JA, Уиллер М.К., Ху Б., Фишман Н.О., Ройер Д., Лаутенбах Е. Факторы риска рецидивирующей колонизации с устойчивым к метициллину Staphylococcus aureus у взрослых и детей, проживающих в сообществах. Инфекционный контроль и больничная эпидемиология 36 (7): 786-93, июль 2015 г.

Milder EA, Rizzi MD, Morales KH, Ross RK, Lautenbach E, Gerber JS: Влияние нового практического руководства на использование антибиотиков при детской тонзиллэктомии. JAMA Otolaryngology — Head & Neck Surgery 141 (5): 410-6, May 2015.

Клигер С.Б., Вендетти Н.Д., Фишер Б.Т., Гербер Дж.С.: Бактериемия золотистого стафилококка у госпитализированных детей: частота и исходы. Инфекционный контроль и больничная эпидемиология 36 (5): 603-5, май 2015 г.

Cluzet VC, Gerber JS, Nachamkin I, Metlay JP, Zaoutis TE, Davis MF, Julian KG, Royer D, Linkin DR, Coffin SE, Margolis DJ, Hollander JE, Mistry RD, Gavin LJ, Tolomeo P, Wise JA, Wheeler М.К., Билкер В.Б., Хан X, Ху Б., Фишман Н.О., Лаутенбах Э.: Продолжительность колонизации и детерминанты более раннего исчезновения колонизации с метициллин-устойчивым золотистым стафилококком.Клинические инфекционные болезни 60 (10): 1489-96, май 2015 г.

Ларру Беатрис, Кауден Картер Л., Заутис Теоклис Э, Гербер Джеффри С.: Использование даптомицина в детских больницах США. Журнал Общества детских инфекционных болезней 4 (1): 60-2, март 2015 г.

Hersh AL, De Lurgio SA, Thurm C, Lee BR, Weissman SJ, Courter JD, Brogan TV, Shah SS, Kronman MP, Gerber JS, Newland JG: Антимикробные программы управления в отдельно стоящих детских больницах. Педиатрия 135 (1): 33-9, январь 2015 г.

Hamilton KW, Gerber JS, Moehring R, Anderson DJ, Calderwood MS, Han JH, Mehta JM, Pollack LA, Zaoutis TE, Srinivasan A, Camins BC, Schwartz DN, Lautenbach E: Point of Prescription Interventions to Improve Antimicrobial Stewardship . Клинические инфекционные болезни 60 (8): 1252-8, январь 2015 г.

2014

Fleming-Dutra KE, Shapiro DJ, Hicks LA, Gerber JS, Hersh AL. Раса, средний отит и выбор антибиотиков. Педиатрия. 2014; 134 (6): 1059-66.

Gerber JS, Prasad PA, Fiks AG, Localio AR, Bell LM и др.Устойчивость преимуществ амбулаторного лечения противомикробными препаратами после прекращения аудита и обратной связи. ДЖАМА. 2014; 312 (23): 2569-70.

Fierro JL, Prasad PA, Localio AR, Grundmeier RW, Wasserman RC и др. Вариативность диагностики и лечения стрептококкового фарингита группы А педиатрами первичного звена. Инфекционный контроль и госпитальная эпидемиология. 2014; 35 Приложение 3: С79-85.

Шимчак Й.Е., Фемстер К.А., Заутис Т.Э., Гербер Я.С. Восприятие педиатрами амбулаторного лечения антимикробными препаратами.Инфекционный контроль и госпитальная эпидемиология. 2014; 35 Дополнение 3: S69-78.

Mehta JM, Haynes K, Wileyto EP, Gerber JS, Timko DR, et al. Сравнение предварительного разрешения и предполагаемого аудита с отзывами о рациональном использовании противомикробных препаратов. Инфекционный контроль и госпитальная эпидемиология. 2014; 35 (9): 1092-9. NIHMSID: NIHMS634334

Mistry RD, Shapiro DJ, Goyal MK, Zaoutis TE, Gerber JS и др. Клиническое ведение инфекций кожи и мягких тканей в отделениях неотложной помощи США. Западный журнал экстренной медицины.2014; 15 (4): 491-8.

Neuman MI, Hall M, Gay JC, Blaschke AJ, Williams DJ и др. Реадмиссии среди детей, ранее госпитализированных с пневмонией. Педиатрия. 2014; 134 (1): 100-9.

Goyal MK, Witt R, Hayes KL, Zaoutis TE, Gerber JS. Соблюдение клиницистом рекомендаций по скринингу подростков на предмет сексуальной активности и инфекций, передаваемых половым путем / вируса иммунодефицита человека. Журнал педиатрии. 2014; 165 (2): 343-7. NIHMSID: NIHMS585308

Ларру Б., Гербер Дж. С..Кожные бактериальные инфекции, вызванные Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes, у младенцев и детей. Детские клиники Северной Америки. 2014; 61 (2): 457-78.

Newland JG, Gerber JS, Weissman SJ, Shah SS, Turgeon C и др. Распространенность и характеристики программ управления антимикробными препаратами в отдельно стоящих детских больницах США. Инфекционный контроль и госпитальная эпидемиология. 2014; 35 (3): 265-71.

Росс Р.К., Херш А.Л., Кронман М.П., ​​Ньюленд Дж. Г., Метджиан Т.А. и др.Влияние руководства Американского общества инфекционных болезней / Общества педиатрических инфекционных болезней по лечению внебольничной пневмонии у госпитализированных детей. Клинические инфекционные болезни: официальное издание Общества инфекционных болезней Америки. 2014; 58 (6): 834-8.

Этчли К.Д., Паппас Дж. М., Кеннеди А. Т., Гроб С. Е., Гербер Дж. С. и др. Использование административных данных для эпиднадзора за инфекциями в области хирургического вмешательства после врожденных операций на сердце приводит к неточным данным о показателях инфицирования в области хирургического вмешательства.Летопись торакальной хирургии. 2014; 97 (2): 651-7; обсуждение 657-8.

2013

Гербер Дж. С., Кронман М. П., Росс Р. К., Херш А. Л., Ньюленд Дж. Г. и др. Определение целей для антимикробного контроля в детских больницах. Инфекционный контроль и госпитальная эпидемиология. 2013; 34 (12): 1252-8.

Тамма П.Д., Робинсон Г.Л., Гербер Дж. С., Ньюленд Дж. Г., Делисл С. М. и др. Тенденции восприимчивости детей к противомикробным препаратам в США. Инфекционный контроль и госпитальная эпидемиология. 2013; 34 (12): 1244-51.

Gerber JS, Prasad PA, Fiks AG, Localio AR, Grundmeier RW и др. Влияние амбулаторного вмешательства по управлению антимикробными препаратами на назначение антибиотиков широкого спектра действия педиатрами первичной медико-санитарной помощи: рандомизированное исследование. ДЖАМА. 2013; 309 (22): 2345-52.

Fierro JL, Prasad PA, Fisher BT, Gerber JS, Coffin SE, Walsh TJ, Zaoutis TE: Окулярные проявления кандидемии у детей. Журнал детских инфекционных заболеваний 32 (1): 84-6, январь 2013 г.

Tamma PD, Newland JG, Pannaraj PS, Metjian TA, Banerjee R, Gerber JS, Weissman SJ, Beekmann SE, Polgreen PM, Hersh AL: Использование внутривенного колистина среди детей в Соединенных Штатах: результаты многоцентрового исследования, случай- Ряд.Журнал детских инфекционных болезней 32 (1): 17-22, январь 2013 г.

Gerber JS, Prasad PA, Localio AR, Fiks AG, Grundmeier RW, Bell LM, Wasserman RC, Rubin DM, Keren R, Zaoutis TE: Расовые различия в назначении антибиотиков педиатрами первичного звена. Педиатрия 131 (4): 677-84, апрель 2013 г.

МакЛеод Л.М., Керен Р., Гербер Дж., Френч Б., Сонг Л., Сэмпсон Н.Р., Флинн Дж., Дорманс Дж. П.: Периоперационное использование антибиотиков для процедур хирургии позвоночника в детских больницах США. Spine 38 (7): 609-16, апрель 2013 г.

2012

Кронман М.П., ​​Гербер Дж.С., Прасад П.А., Адлер А.Л., Басс Дж.А., Ньюленд Дж.Г., Шах К.М., Зерр Д.М., Фенг Р., Гроб С.Е., Заутис Т.Э .: Различия в использовании антибиотиков у детей, госпитализированных с обострением воспалительного заболевания кишечника: многоцентровая проверка Изучение. Журнал Общества детских инфекционных болезней 1 (4): 306-313, декабрь 2012 г.

2010

Gerber JS, Newland JG, Coffin SE, Hall M, Thurm C, Prasad PA, Feudtner C, Zaoutis TE: Различия в использовании антибиотиков в детских больницах.Педиатрия 126 (6): 1067-73, декабрь 2010 г.

Херигон Дж. С., Херш А. Л., Гербер С., Заутис Т. Е., Ньюленд Дж. Г.: Антибиотикотерапия инфекций золотистого стафилококка в детских больницах США, 1999-2008 гг. Педиатрия 125 (6): e1294-300, июнь 2010 г.

Mascitti KB, Gerber JS, Zaoutis TE, Barton TD, Lautenbach E: Предпочтительные стратегии лечения и профилактики рецидивирующих метициллин-резистентных инфекций кожи и мягких тканей Staphylococcus aureus, ассоциированных с населением: опрос взрослых и педиатров.Американский журнал инфекционного контроля 38 (4): 324-8, май 2010 г.

2009

Gerber JS, Coffin SE, Smathers SA, Zaoutis TE: Тенденции заболеваемости метициллинорезистентной инфекцией Staphylococcus aureus в детских больницах США. Клинические инфекционные болезни 49 (1): 65-71, июль 2009 г.

Нолан С.М., Гербер Дж.С., Заутис Т.Э., Прасад П., Реттиг С., Гросс К., Макгоуэн К.Л., Рейли А.Ф., Гроб С.Е.: Вспышка колонизации устойчивых к ванкомицину энтерококков среди педиатрических онкологических пациентов.Инфекционный контроль и больничная эпидемиология 30 (4): 338-45, апрель 2009 г.

2002

Андерсон К.Ф., Гербер Дж. С., Моссер Д.М.: Модуляция функции макрофагов с помощью иммунных комплексов IgG. Журнал исследований эндотоксинов 8 (6): 477-81, 2002.

2001

Гербер Дж. С., Моссер Д. М.: Изменение токсичности липополисахаридов путем лигирования рецепторов Fc-гамма макрофагов. Журнал иммунологии 166 (11): 6861-8, июнь 2001 г.

1996

Хинтон Д.М., Марч-Амегадзи Р., Гербер Дж. С., Шарма М.: Средняя транскрипционная система бактериофага Т4: Т4-модифицированная РНК-полимераза; AsiA, связывающий белок сигма 70; и активатор транскрипции MotA.Методы в энзимологии 274: 43-57, 1996.

Гербер Дж. С., Хинтон Д. М.: N-концевая мутация в гене motA бактериофага Т4 дает белок, который связывает ДНК, но не способен активировать транскрипцию. Журнал бактериологии 178 (21): 6133-9, ноябрь 1996 г.

Hinton DM, March-Amegadzie R, Gerber JS, Sharma M: Характеристика пре-транскрипционных комплексов, созданных на среднем промоторе бактериофага T4: участие активатора T4 MotA и белка T4 AsiA, связывающего сигма-70 белка, в образовании открытого комплекса.Журнал молекулярной биологии 256 (2): 235-48, февраль 1996 г.

Рефераты

2018

Пул Н.М., Кронман М.П., ​​Гербер Дж. С., Болдуин Л. М., Зерр Д. М.: Назначение антибиотиков детям в клиниках семейной медицины в рамках сети практических исследований, 2014-2017 гг. ID Week 2018, Сан-Франциско, Калифорния, октябрь 2018 г.

Gerber JS, Росс RK, Szymczak J, Xiao R, Localio AR, Grundmeier RW, Rettig SL, Teszner E, Canning DA, Coffin SE: Инфекции после детской амбулаторной хирургии: заболеваемость и факторы риска.ID Week 2018, Сан-Франциско, Калифорния, октябрь 2018 г.

Hayes M, Schriver E; Chiotos K, Metjian T, Gerber JS: Использование местных данных для определения целевых групп для противогрибковой профилактики в отделениях интенсивной терапии новорожденных и младенцев (N / IICU). Международная конференция по контролю над противомикробными препаратами в педиатрии, 2018 г., Сент-Луис, Миссури, июнь 2018 г.

Flannery DD, Mukhopadhyay S, Gerber JS, Puopolo KM: Характеристики доставки и риск раннего сепсиса новорожденных. PAS 2018, Торонто, май 2018 г.

2017

Tribble A, Ross RK, Gerber, JS: Назначение антибиотиков для педиатрической внебольничной пневмонии в детских больницах и больницах общего профиля после выпуска национальных рекомендаций.ID Week 2017, Сан-Диего, Калифорния, октябрь 2017 г.

Tribble A, Lee BR, Handy L, Gerber JS, Hersh AL, Kronman M, Terrill C, Newland JG и SHARPS Collaborative: Соответствие назначения антибиотиков в детских больницах США: Национальное исследование точечной распространенности. ID Week 2017, Сан-Диего, Калифорния, октябрь 2017 г.

Handy, LK, Gerber, JS, Bryan, M, Zaoutis, TE, Feemster, KA: сравнительная эффективность бета-лактамов по сравнению с азитромицином для лечения амбулаторной педиатрической внебольничной пневмонии.ID Week 2017, Сан-Диего, Калифорния, октябрь 2017 г.

Hamdy R, Dona D, Gerber JS: Бактериемия Staphylococcus aureus у детей: эффект устойчивости к метициллину. ID Week 2017, Сан-Диего, Калифорния, октябрь 2017 г.

Гербер Дж.С., Росс Р.К., Брайан М., Локалио А.Р., Заутис Т.Е., Вассерман Р., Фикс А: Побочные эффекты антибиотиков при острых респираторных инфекциях у детей: сравнение двух источников данных. ID Week 2017, Сан-Диего, Калифорния, октябрь 2017 г.

Downes KJ, Schriver E, Russo M, Weiss SL, Fitzgerald JC, Balamuth F, Kubis SE, Tolomeo P, Bilker WB, Han JH, Lautenbach E, Coffin SE, Gerber JS для программы CDC Prevention Epicenters: внедрение прагматичного Алгоритм на основе биомаркеров для руководства использованием антибиотиков в педиатрическом отделении интенсивной терапии: исследование стратегии оптимизации антибиотиков при сепсисе (OASIS) II.ID Week 2017, Сан-Диего, Калифорния, октябрь 2017 г.

Дона, Д., Хамди Р., Заутис Т.Э., Гербер Дж.С.: Лечение бактериемии Staphylococcus aureus: всегда ли требуется внутривенная терапия? ID Week 2017, Сан-Диего, Калифорния, октябрь 2017 г.

Шимчак Ю.Е., Баркман Д.; Conaboy K; Gerber JS: Определение ориентированных на пациента и семью результатов применения антибиотиков при острых инфекциях дыхательных путей у детей. PAS 2017, Сан-Франциско, Калифорния, май 2017 г.

Шимчак Дж., Баркман Д., Клигер С., Миллер М., Фикс А., Гербер Дж. С.: Определение ориентированных на пациента и семью результатов применения антибиотиков при острых инфекциях дыхательных путей у детей.PAS 2017, Сан-Франциско, Калифорния, май 2017 г.

Gerber JS, Ross RK, Bryan M, Localio AR, Szymczak J, Wasserman R, Barkman D, Odeniyi F, Conaboy K, Bell LM, Zaoutis TE, Fiks A: Сравнительная эффективность антибиотиков широкого и узкого спектра для лечения острых респираторных путей Инфекции у детей. PAS 2017, Сан-Франциско, Калифорния, май 2017 г.

Flannery D, Gerber JS, Ross RK, Mukhopadhyay S, Puopolo KM: Временные тенденции в использовании антибиотиков для риска раннего сепсиса среди очень недоношенных детей в Соединенных Штатах.PAS 2017, Сан-Франциско, Калифорния, май 2017 г.

Denburg M, Jemielita T, Goldfarb D, Wu Q, Copelovitch L, Gerber JS, Tasian G: Устное воздействие антибиотиков и возникновение почечнокаменной болезни. PAS 2017, Сан-Франциско, Калифорния, май 2017 г.

Книги

Разделы

2012

Гербер, Дж. С. и Заутис, Т. Е.: Клинические синдромы инфекций, связанных с устройствами. Принципы и практика детских инфекционных болезней, 4-е изд. Лонг, С.С., Пикеринг, Л.К., и Пробер, К.Г. (ред.). Elsevier, 2012 Примечания: Глава 102.

2008

Гербер, JS: Антибактериальные агенты. Детские инфекционные болезни. Бергельсон Дж. М. (ред.). Mosby, Inc. Стр .: 18-28, 2008.

Плакаты и презентации

Приглашенные лекции

2019

Гербер JS. «Pediatric Grand Rounds», Государственная детская больница Пенсильвании, Херши, Пенсильвания. Январь, 2019.

2018

Гербер JS. «Возможные передовые методы рационального использования неонатальных антибиотиков», PAS 2018, Торонто, Онтарио. Май 2018.

Гербер JS.«Вмешательства по рациональному использованию антибиотиков в отношении маркировки аллергии у педиатрических амбулаторных пациентов», PAS 2018, Торонто, Онтарио. Май 2018.

Гербер JS. «Антимикробная помощь в амбулаторных условиях», Миннесотская ежегодная научно-исследовательская конференция по вопросам рационального использования антибиотиков, Сент-Пол, Миннесота. Май 2018.

Гербер JS. «Антимикробные препараты: перспективы педиатрии», Симпозиум Института иммунологии, Ветеринарная школа Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания. Март 2018.

Гербер JS. «Амбулаторное управление антимикробными препаратами: эффективные вмешательства», Медицинские осмотры комиссара по УПП, Вестчестерский медицинский центр, Валгалла, штат Нью-Йорк.Февраль 2018.

2017

Гербер JS. «Грантовое финансирование исследований в области управления», Семинар по исследованиям в области управления противомикробными препаратами SHEA, 2017 г., Чикаго, Иллинойс. Ноябрь, 2017.

Гербер JS. «Утверждение рецепта против предполагаемого аудита и обратной связи: что мне делать?», IDWeek 2017, Сан-Диего, Калифорния. Октябрь, 2017.

Гербер JS. «Амбулаторное управление антимикробными препаратами», учебный семинар Института клинических и лабораторных стандартов, Филадельфия, Пенсильвания. Июнь, 2017.

Гербер JS.«Сравнительная эффективность антибиотиков при респираторных инфекциях», PAS 2017, Сан-Франциско, Калифорния. Май, 2017.

Гербер JS. «Вмешательства по улучшению амбулаторного назначения антибиотиков детям», PAS 2017, Сан-Франциско, Калифорния. Май, 2017.

Гербер JS. «Антимикробное управление и микробиом», Pediatric Grand Rounds, Einstein Hospital, Philadelphia, PA. Апрель, 2017.

Гербер JS. «Вирусные инфекции у детей, связанные со здравоохранением», Центры по контролю и профилактике заболеваний, Атланта, Джорджия.Янв, 2017.

2016

Гербер JS. «Амбулаторное управление антимикробными препаратами», Grand Rounds в педиатрии, Медицинский центр Cedars Sinai, Лос-Анджелес, Калифорния. Декабрь, 2016.

Гербер JS. «Использование интерактивных прогностических антибиотиков для выбора эмпирической терапии», 46-й ежегодный симпозиум, Восточно-Пенсильванский филиал, Американское общество микробиологии, Филадельфия, Пенсильвания. Ноябрь, 2016.

Гербер JS. «Амбулаторное управление антимикробными препаратами», Grand Rounds, Детская больница Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания.Ноябрь, 2016.

Гербер JS. «Более разумное и правильное использование антибиотиков», Ежегодное собрание PCORI, Национальная гавань, Мэриленд. Ноябрь, 2016.

Гербер JS. «Механизмы финансирования исследований по рациональному использованию», семинар по исследованиям в области рационального использования противомикробных препаратов, 2016 г., Сан-Диего, Калифорния. Ноябрь, 2016.

Гербер JS. «Амбулаторное управление антимикробными препаратами», ID Week, Новый Орлеан, Лос-Анджелес. Октябрь, 2016.

Гербер JS. «Вовлечение пациентов в ваши исследования», Весенняя конференция Общества эпидемиологии здравоохранения Америки, 2016 г., Атланта, Джорджия.Май, 2016.

Гербер JS. «Аллергии, взаимодействия и побочные эффекты», Весенняя конференция Общества эпидемиологии здравоохранения Америки, 2016 г., Атланта, Джорджия. Май, 2016.

Гербер JS. «Antimicrobial Stewardship», Grand Rounds, Детская больница Марии Фарери, Валгалла, Нью-Йорк. Апрель, 2016.

Гербер JS. «Разработка алгоритма на основе биомаркеров для улучшения использования антибиотиков в отделениях интенсивной терапии», Центры по контролю и профилактике заболеваний, Атланта, Джорджия. Янв, 2016.

.