Гк рф иждивенец: ГК РФ Статья 1148. Наследование нетрудоспособными иждивенцами наследодателя / КонсультантПлюс

Содержание

С кем придется разделить наследство в 2022 году, несмотря на наличие завещания | Юридические тонкости

Если наследник полагает, что он единственный, кто имеет право на наследство, на деле это может оказаться вовсе не так.

В определенных случаях его могут обязать разделить свое наследство с другими родственниками, а порой даже и вовсе не с родственниками наследодателя. Разберем на примерах, с кем придется разделить наследство в 2022 году.

1. Близкие родственники

Во-первых, не стоит списывать со счетов внуков. Если нет завещания и на наследство претендуют родственники из первой очереди (это дети, родители и супруг наследодателя), с внуками им тоже придется поделиться, если:

— один родитель внука (по которому идет линия родства с наследодателем) скончался до того, как открылось наследство.

В таком случае внуку причитается доля в наследстве, которую получил бы его родитель, будь он жив (ст. 1142 ГК РФ).

Например: за наследством мужчины обратился его сын. Но получить все имущество отца ему не удалось: половину пришлось отдать внукам наследодателя от второго сына, т. к. того не стало несколько лет назад и право на его долю перешло к детям.

Во-вторых, дети, родители и супруг наследодателя получают обязательную долю в наследстве даже если все завещано другому — при условии, что они нетрудоспособны на день открытия наследства (ст. 1149 ГК РФ).

Сейчас закон признает нетрудоспособными не только инвалидов, но и тех, кто перешагнул порог предпенсионного возраста (для женщин это 55 лет, для мужчин — 60 лет).

Соответственно, в 2022 году число родственников с правом на обязательную долю пополнят женщины 1967 г.р. и мужчины 1962 г.р.

Например, мужчина завещал все свое имущество жене. Но после открытия наследства его дочь от другого брака, инвалид 3 группы, может получить свою обязательную долю — 1/4 (т.  к. при отсутствии завещания она получила бы 1/2).

2. Дальние родственники

Родственники из дальних очередей наследования (братья, сестры, тети, дяди и т. д. — ст. 1143 — 1145 ГК РФ) могут получить наследство наравне с близкими родственниками из первой очереди, если они нетрудоспособны и докажут, что находились на иждивении наследодателя (в течение, как минимум, последнего года).

А шансы установить иждивение через суд стали в последнее время выше. Верховный суд РФ подтвердил, что иждивенец — это не обязательно тот, кто совсем не имел дохода и жил исключительно за счет наследодателя. Он вполне мог получать пенсию или другие выплаты.

И даже если они превышали доходы наследодателя, все равно можно установить иждивение — при условии, что помощь наследодателя была основным источником для обеспечения потребностей нетрудоспособного (ВС РФ, определение № 8-КГ21-4-К2).

Например, дядя периодически присылал своей племяннице, инвалиду 2 группы, деньги на лечение.

Несмотря на то, что она получала пенсию, суд может признать ее иждивенцем — и детям покойного дяди придется разделить наследство с ней.

Это правило работает даже, если дядя напишет завещание в пользу кого-то другого. Тогда иждивенца признают обязательным наследником — и он тоже сможет получить долю в наследстве (правда, только половину от той, что полагалась бы ему без завещания — ст. 1149 ГК РФ).

3. Вовсе не родственники

Во-первых, они могут получить часть наследства, если также нетрудоспособны и докажут, что были иждивенцами наследодателя.

Но при этом должно еще подтверждаться, что они еще и жили вместе с наследодателем.

При выполнении всех трех условий им полагается равная доля в наследстве с остальными родственниками, а при наличии завещания в пользу кого-то другого они могут претендовать на обязательную долю.

Например, сожительница, которой исполнилось 55 лет, подтверждает, что они с наследодателем жили только за счет его доходов — т.  е. она была на его иждивении. В таком случае дети покойного должны разделить наследство с ней.

Во-вторых, на часть наследства может претендовать даже бывший супруг наследодателя, если после развода с ним они не разделили имущество, нажитое браке.

За бывшим супругом сохраняется право на половину совместной собственности, поэтому после открытия наследства он может потребовать свою долю у наследников (например, ВС РФ, определение № 18-КГ15-202).

© Сивакова И. В., 2021 г.

Особенности наследования нетрудоспособными иждивенцами наследодателя. 

В статье 1148 ГК РФ сохранены основные условия участия в наследовании нетрудоспособных иждивенцев наследодателя: как и по ранее действовавшему законодательству они наследуют вместе и наравне с той очередью наследников по закону, которая призывается к наследованию.  Кроме того, для призвания их к наследованию необходимо, чтобы они были нетрудоспособны и находились на иждивении наследодателя не менее года до его смерти.
К нетрудоспособным иждивенцам наследодателя следует относить: женщин, достигших 55, и мужчин – 60 лет, инвалидов I, II, и III групп независимо от того, назначена ли названным лицам пенсия по старости или инвалидности, а также лиц, не достигших шестнадцати лет, а учащихся – восемнадцати лет. Лица, ушедшие на пенсию по льготным основаниям,  в круг наследников по закону как нетрудоспособные иждивенцы не включаются.
Состоявшими на иждивении наследодателя следует считать нетрудоспособных лиц, находившихся на полном содержании наследодателя или получавших от наследодателя такую помощь, которая была для них основным и постоянным источником средств к существованию. Таким образом, возможно как полное иждивение, так и наличие у иждивенца иных, менее значительных по сравнению с помощью наследодателя источников средств. Поэтому сам по себе факт получения зарплаты, пособия, пенсии, стипендии и т.п. не может являться основанием для отказа в установлении факта нахождения на иждивении, если предоставляемые умершим при жизни средства являлись для лица основным и постоянным источником существования.

Периодическая денежная помощь не может служить основанием к признанию лица иждивенцем.
Нетрудоспособными иждивенцами наследодателя могут являться как лица, связанные с наследодателем родственными узами  (дедушка, бабушка и др.), так и лица, не состоящие с ним в родстве. По этому основанию могут быть призваны к наследованию лица, состоявшие с наследодателем в фактических брачных отношениях, его бывший супруг.
Доказательствами факта иждивения могут служить справки местной администрации, жилищно-эксплуатационной организации, справки с места работы наследодателя о наличии у него иждивенцев, справка органа социальной защиты населения о назначении пенсии по случаю потери кормильца. Юридический факт нахождения на иждивении может быть установлен судом  в порядке особого производства (гл. 28 ГПК  РФ).
Нетрудоспособность иждивенца, связанная с возрастом, может подтверждаться, свидетельством о рождении, паспортом, пенсионным удостоверением, а нетрудоспособность по состоянию здоровья устанавливается по справке ВТЭК (МСЭК).
Новые положения ст. 1148 ГК РФ, не известные ранее действовавшему законодательству, касаются разделения нетрудоспособных иждивенцев на две группы.
В первую группу включены иждивенцы наследодателя, относящиеся к наследникам по закону  второй и последующих очередей. Как нетрудоспособные иждивенцы они наследуют в том случае, когда имеются наследники предшествующей очереди, которая и призывается к наследованию (например, нетрудоспособный иждивенец является наследником третьей очереди, но есть также наследники второй очереди). Поэтому, если нетрудоспособные иждивенцы  относятся к наследникам  первой очереди, они наследуют именно в этом качестве, основания для призвания их к наследованию как нетрудоспособных иждивенцев отпадают.
Для нетрудоспособных иждивенцев этой группы закон не связывает факт иждивенчества с совместным проживанием с наследодателем. Иждивение может состоять, например, в систематическом получении гражданином, проживающем отдельно от наследодателя, средств  к существованию. Также по смыслу закона нет необходимости, чтобы они были нетрудоспособными в течение года до смерти наследодателя. Достаточно, чтобы они стали нетрудоспособными к моменту открытия наследства.
Таким образом, для призвания к наследованию нетрудоспособных иждивенцев первой группы необходимо одновременное наличие трех условий: 1) гражданин должен относиться к наследникам по закону второй или любой из последующих очередей; 2) нетрудоспособность по возрасту или по болезни; 3) нахождение на иждивении не менее одного года до смерти наследодателя, т.е. получение либо полного содержания от наследодателя, либо такой материальной помощи, которая была основным и постоянным источником средств к существованию.
Вторую группу образуют нетрудоспособные иждивенцы наследодателя, которые не входят в круг наследников по закону ни первой, ни последующих очередей. В данном случае речь идет лицах, которые при обычных условиях не были бы призваны к наследованию по закону. Возможность участия в наследовании им предоставляет именно факт иждивенчества.
Для этих лиц, помимо нетрудоспособности и нахождении на иждивении наследодателя не менее года до его смерти, закон устанавливает еще одно условие: совместное проживание   с  наследодателем. К числу нетрудоспособных иждивенцев этой категории могут быть отнесены бывший супруг наследодателя, его фактические воспитатели, находившиеся на его иждивении и проживавшие совместно с ним не менее года до его смерти.
При отсутствии других наследников по закону нетрудоспособные иждивенцы второй группы наследуют самостоятельно в качестве наследников восьмой очереди (п. 3 ст. 1148 ГК РФ). Закон не упоминает об иждивенцах первой группы, поскольку они сами относятся к наследником по закону какой-либо очереди, кроме первой, и при отсутствии других наследников наследуют  как наследники своей очереди.

Признание иждивенцем наследодателя в судебном порядке.

 

Иждивенцем наследодателя признаются граждане, указанные в ст. 1148 ГК РФ и  пп. а и пп. в п. 31  Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 29.

05.2012 N 9 «О судебной практике по делам о наследовании».

Выражаясь простым языком в первом случае иждивенцем может быть признано лицо, входящее в круг наследников, получающие материальную поддержку от умершего, которая была для него основным или существенным источником доходов не менее года вне зависимости от того проживал или нет иждивенец с наследодателем. Во втором случае иждивенцем может быть признано лицо, не входящее в круг наследников, которое проживало с наследодателем не менее года и также получало от него материальную поддержку.

Для того чтобы вступить в наследство как иждивенцу необходимо устанавливать факт нахождения на иждивении в судебном порядке.

Для начала надо обратиться к нотариусу, открывшему наследство с письменным заявление о вступлении в наследство. Нотариус должен дать письменный отказ, так как в круг наследников заявитель не входит и рекомендовать в судебном порядке установить факт нахождения на иждивении.

Необходимо собрать доказательства: документы подтверждающие доходы и расходы заявителя (справки о размере заработной платы, пенсий, пособий и т. п. квитанции об оплате квартплаты, лечения, лекарств, чеки на крупные покупки, кредитные договоры на необходимые нужды иждивенца и т.п.), документы, подтверждающие совместное проживание с наследодателем (поквартирная карта, справка о составе семьи, характеристика с места жительства и т.п.). Необходимо в суд привести свидетелей, которые подтвердят совместное проживание с наследодателем в определенном законом случае, траты иждивенца и другие важные для вынесения решения вопросы.

В исковом заявление к наследникам, которыми необходимо предъявить требования об установлении факта нахождении на иждивении (признании иждивенцем), установлении права наследство на наследуемое имущество, признании права собственности на наследуемое имущество. Третьим лицом в исковом заявлении необходимо указать нотариуса, который открыл наследство. Необходимо также оплатить государственную пошлину за требования неимущественного характера и госпошлину за имущественное требование из расчета рыночной стоимости наследуемого имущества (пп. 1, 3 п. 1 ст. 333.19 НК РФ).

 

Судебный процесс в данном случае хлопотный нервный. Заключайте, товарищи, законный брак. Лучше один раз сходить в загс чем обивать пороги суда.

Катушки

RF: Практическое руководство для нефизиков

1. Лаутербур ПК. Формирование изображения индуцированными локальными взаимодействиями: примеры использования ядерного магнитного резонанса. Природа 1973; 242: 190–191. [PubMed] [Google Scholar]2. Мэнсфилд П. и Граннелл ПК. ЯМР «дифракция» в твердых телах. J физ. C 1973; 6: L422–L426. [Google Академия]3. Кломп Д.В.Дж., ван дер Грааф М, Виллемсен МААП, ван дер Меулен АРМ, Heerschap A. Передающая/приемная катушка для оптимальной 1H MR-спектроскопии головного мозга у педиатрических пациентов при 3T.МАГМА 2004; 17:1–4. [PubMed] [Google Scholar]4. Улица АМ. Конструкция радиочастотного переключателя. Учебный курс IEEE 2000: Как проектировать радиочастотные схемы 2000; 27:1–7. [Google Академия]

5. Токумицу Т, Тойода I, Айкава М. Низковольтный, высокомощный T/R переключатель MMIC с использованием резонаторов LC. На симпозиуме IEEE по монолитным схемам микроволнового и миллиметрового диапазона, Атланта, Джорджия, 1993.

6. Сандрамурти С.В., Эпель Б, Мейлер С, Халперн ХДж. Переключатель передачи/приема на основе пассивного двойного циркулятора для использования с отражающими резонаторами в импульсном электронном парамагнитном резонансе.Концепции Magn Reson Часть B 2009; 35Б: 133–138. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]7. Макробби Д.У., Мур ЭА, Грейвс М.Дж., Принц МР. МРТ — От картинки к протону, 2-е изд. Нью-Йорк: Издательство Кембриджского университета, 2006. [Google Академия]

8. Райт СМ. Массивы петель приемника. Энциклопедия магнитного резонанса 2011; 1–13.

9. Барри Смит Н., Уэбб А. Введение в медицинскую визуализацию — физика, инженерия и клинические приложения. Кембридж, Великобритания: Издательство Кембриджского университета, 2010. [Google Академия] 10.Миспелтер Дж., Лупу М, Бриге А. ЯМР-зонды для биофизических и миомедицинских экспериментов: теоретические принципы и практические рекомендации. Лондон: Издательство Имперского колледжа, 2006. [Google Академия] 11. Чен КН, Холт Ди, Санк Виджей. Квадратурные катушки обнаружения — дальнейшее улучшение чувствительности в √2 раза. Джей Магн Резон 1983; 54: 324–327. [Google Академия] 12. Гловер Г.Х., Хейс К.Э., Пелк, штат Нью-Джерси, и соавт. Сравнение линейной и круговой поляризации для магнитно-резонансной томографии. Джей Магн Резон 1985; 54: 255–270.[Google Академия] 13. Холт Д.И. Приемник ЯМР: описание и анализ конструкции. Программа ЯМР Спектроск 1978; 41–77. [Google Академия]

14. Кауфман Л, Аракава М, Макартен БМ, Фен Дж. Х., Краснор С. Переключаемый массив радиочастотных катушек МРТ с отдельными катушками, имеющими разные и перекрывающиеся поля зрения. Патент США 4.881.034, 14 ноября 1989 г.

15. Акерман Дж.Дж., Роща ТД, Вонг Г.Г., Гадиан Д.Г., Радда ГК. Картирование метаболитов у целых животных с помощью ЯМР 31P с использованием поверхностных катушек. Природа 1980; 283: 167–170.[PubMed] [Google Scholar] 16. Олигер М. А., Содиксон ДК. Индукционная конструкция массива катушек для параллельной МРТ. ЯМР Биомед 2006; 19: 300–315. [PubMed] [Google Scholar]

17. Боскамп Э.Б., Линдси С.А., Лорбецкий Дж. Э. О вкладе шума катушки в ОСШ в зависимости от диаметра катушки, температуры, частоты и расстояния нагрузки. В: Proc 13th Annual Meeting ISMRM, Miami; 2005.

18. Реквардт Х, Офферманн Дж, Кесс Х, Краузе Н, Вебер Х. Поверхностная катушка с изменяемой геометрией: новый инструмент для МРТ позвоночника.Радиология 1987; 165: 572–573. [PubMed] [Google Scholar]

19. Боскамп Э.Б. Новая революция в технологии поверхностных катушек: матричные поверхностные катушки. В: Протокол 6-й ежегодной научной встречи и конференции ISMRM, Нью-Йорк; 1987.

20. Райт С.М., Магин РЛ, Келтон Дж.Р. Решетки взаимно связанных приемных катушек: теория и применение. Магн Резон Мед 1991; 17: 252–268. [PubMed] [Google Scholar] 21. Ремер ПБ, Эдельштейн В. А., Хейс К.Э., Соуза СП, Мюллер ОМ. ЯМР фазированная решетка. Магн Резон Мед 1990; 16: 192–225. [PubMed] [Google Scholar] 22. Фенн Эй Джей, Темме ДХ, Делани ВП, Кортни ВЭ. Развитие радиолокационной техники с фазированной антенной решеткой. Линкольн Лаб Дж. 2000;12:321–340. [Google Академия] 23. Баланис СА. Теория антенн: анализ и проектирование, 4-е изд. Хобокен, Нью-Джерси: Wiley-Interscience, 2015. [Google Академия] 24. Хейс К.Э., Хаттес Н, Ремер ПБ. Объемная визуализация с помощью МР-фазированных решеток. Магн Резон Мед 1991; 18: 309–319. [PubMed] [Google Scholar] 25. Raaijmakers AJE, Луйтен ПР, Ван ден Берг КАТ. Дипольные антенны для визуализации тела в сверхвысоком поле: сравнение с рамочными катушками.ЯМР Биомед 2016;29:1122–1130. [PubMed] [Google Scholar]

26. Уиггинс ГК. Петли микширования и электрические дипольные антенны для повышения чувствительности на уровне 7 тесла. В: Протокол 21-го ежегодного собрания ISMRM, Солт-Лейк-Сити; 2013.

27. Хейс К.Э., Эдельштейн В. А., Шенк Дж. Ф., Мюллер О.М., Иш М. Эффективная высокооднородная радиочастотная катушка для ЯМР-изображения всего тела при 1,5 Тл. Джей Магн Резон 1985; 63: 622–628. [Google Академия] 28. Авдиевич НИ. Поперечные электромагнитные (ТЭМ) катушки для конечностей.eMagRes 2011. [Google Академия] 29. Серебряный МС, Джозеф Р.И., Холт Д.И. Селективная инверсия спина в ядерном магнитном резонансе и когерентной оптике через точное решение уравнения Блоха-Риккати. Физика, версия А 1985; 31: 2753–2755. [PubMed] [Google Scholar] 30. Бендалл М.Р., Гордон РЕ. Глубина и перефокусировка импульсов предназначены для многоимпульсного ЯМР с поверхностными катушками. Джей Магн Резон 1983; 53: 365–385. [Google Scholar]

31. Банда С, Клоос М, Уиггинс ГК. Перемежающийся монопольный массив передачи-приема для визуализации мозга 7T.В: Протокол 22-го ежегодного собрания ISMRM, Милан; 2014.

32. Ли В, Клоос М.А., Содиксон Д.К., Wiggins GC, Параллельная конструкция массива приемопередатчиков с использованием модифицированного складчатого диполя для приложений с корпусом 7T. В: Протокол 21-го ежегодного собрания ISMRM, Солт-Лейк-Сити; 2013.

33. Лакшманан К, Клоос М, Латтанци Р, Содиксон ДК. Круглый диполь. В: Протокол 22-го ежегодного собрания ISMRM, Милан; 2014.

34. Эрьяман Ю, Герин Б, Косиор Р, Адальстейнссон Э., Уолд ЛЛ. Комбинированные петлевые  + дипольные решетки для визуализации головного мозга 7T.В: Протокол 21-го ежегодного собрания ISMRM, Солт-Лейк-Сити; 2013.

35. Латтанци Р, Уиггинс ГК, Чжан Б, Дуан Кью, Браун Р, Содиксон ДК. Приближение к предельному собственному отношению сигнал/шум с помощью рамочных и дипольных антенн. Магн Резон Мед 2018; 79: 1789–1803. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]36. Raaijmakers AJE, Ван ден Берг КАТ. Антенны как элементы поверхностной решетки для визуализации тела при сверхвысокой напряженности поля. eMagRes 2012;1. [Google Академия] 37. Рейковски А. Теория и конструкция катушек с синтезированной матрицей для магнитно-резонансной томографии.Техасский университет A&M, 1996. [Google Академия] 38. Карлсон Дж. Алгоритм реконструкции изображений ЯМР на основе нескольких катушек РЧ-приемника. Джей Магн Резон 1987; 75: 376–380. [Google Академия] 39. Хатчинсон М, Рафф У. Быстрое получение данных МРТ с использованием нескольких детекторов. Магн Резон Мед 1988; 6: 87–91. [PubMed] [Google Scholar]40. Браун РВ, Ченг ЮН, Хааке Э.М., Томпсон М.Р., Венкатесан Р. Магнитно-резонансная томография — Физические принципы и разработка последовательности, 2-е изд. Хобокен, Нью-Джерси: Уайли Блэквелл, 2014.[Google Академия] 41. Райт АС, Лемдиасов Р, Конник Т.Дж. и соавт. Передающая катушка Гельмгольца со встроенной приемной матрицей для МРТ трабекулярной кости в дистальном отделе большеберцовой кости с высоким разрешением при 7 Тл J Magn Reson Med 2011; 210:113–122. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]42. Гендоуз Л, Гали СМОА, Хеджедж А, Эсканье Дж. Усовершенствованные магнитно-резонансные катушки типа Гельмгольца с высокой однородностью B1 — сферические и эллипсоидальные системы с четырьмя катушками. Концепции Magn Reson Часть B 2008; 33Б:9–20.[Google Академия]43. Смит М.Р., Чжай Х, Курпад К. Н., Хартер РД, Файн СБ. Возбудите и получите соленоидную радиочастотную катушку для вмешательств на молочных железах под контролем МРТ. Джей Магн Резон Мед 2011;65:1799–1804. [PubMed] [Google Scholar]44. Гинзберг Д.М., Мельхнер МДж. Оптимальная геометрия катушек седловидной формы для создания однородного магнитного поля. Rev Sci Instr 1970;41:122. [Google Академия] 45. Олдерман Д.В., Грант Дм. Эффективная конструкция катушки развязки, снижающая нагрев проводящих образцов в сверхпроводящих спектрометрах.Джей Магн Резон 1969; 36: 447–451. [Google Академия] 46. Болинджер Л, Праммер М.Г., Ли младший JS. Многочастотная катушка с очень однородным полем B1. Джей Магн Резон 1989; 81: 162–166. [Google Академия] 47. Уолд Л.Л., Адальстейнссон Э. Технология параллельной передачи для МРТ высокого поля. Магнитом Флэш 2009; 1: 124–135. [Google Академия] 48. Мурбах М, Нойфельд Э, Кайнц В, Прюсман КП, Кастер Н. Поглощение РЧ всего тела и локальное на моделях человека в зависимости от анатомии и положения внутри катушки 1,5T MR. Магн Резон Мед 2014;71:839–845. [PubMed] [Google Scholar]49. Аткинсон ИК, Рентерия Л, Бурд Х, Пилскин Н.Х., Талборн КР. Безопасность МРТ человека в статическом поле выше рекомендованного FDA 8T: визуализация натрия при 9,4T не влияет на жизненные показатели или когнитивные способности. Резонансная визуализация J Magn 2007; 26:1222–1227. [PubMed] [Google Scholar]50. Фудзита Х, Чжэн Т, Ян Х, Финнерти МДж, Ханда С. Поверхностные высокочастотные приемные катушки: искусство LC-схемы. Резонансная визуализация J Magn 2013; 38:12–25. [PubMed] [Google Scholar]51.Холт Ди, Ричардс Р.Э. Отношение сигнал/шум в эксперименте по ядерному магнитному резонансу. Джей Магн Резон 1976; 24:71–85. [PubMed] [Google Scholar]52. Холт Ди, Лаутербур ПК. Чувствительность зевгматографического эксперимента с образцами человека. Джей Магн Резон 1979; 34: 425–433. [Google Академия]53. Редпат ТВ, Уиггинс Си Джей. Оценка достижимых отношений сигнал-шум приемо-передающих катушек МРТ на основе измерений мощности радиочастот: применение в контроле качества. Физ Мед Биол 2000; 45: 217–227.[PubMed] [Google Scholar]54. Хаазе А, Одой Ф, фон Киенлин М. и соавт. ЯМР-зонды для приложений in vivo. Концепции Magn Reson 2000; 61: 361–388. [Google Академия]56. Рейковский А, Райт С, Портер Дж. Проектирование согласующих цепей для малошумящих предусилителей. Магн Резон Мед 1995; 33:848. [PubMed] [Google Scholar]

57. Уиггинс ГК, Браун Р, Чжан Б. и др. Ухудшение отношения сигнал-шум в приемных решетках из-за шумовой связи предусилителя и метод смягчения. В: Proc 20th Annual Meeting ISMRM, Мельбурн; 2012.

58. Вестер М, Бибер С, Ренер Р, Уиггинс ГК, Браун Р, Содиксон ДК. Уменьшение индуктивной связи в катушках массива за счет широкополосного согласования портов. В: Proc 20th Annual Meeting ISMRM, Мельбурн; 2012.

59. Чжан Б, Содиксон Д.К., Клоос М.А. Массивы детекторов с высоким импедансом для магнитного резонанса. Инструмент Обнаружение Биол Физ 2017: 1–16. [Google Академия] 60. Деббинс Дж. П., Фелмли Дж. П., Ридерер С.Дж. Фазовое выравнивание данных нескольких поверхностных катушек для уменьшения требований к полосе пропускания и реконструкции. Магн Резон Мед 1997; 38:1003–1011. [PubMed] [Google Scholar]61. Райт С.М., Уолд ЛЛ. Теория и применение матричных катушек в МР-спектроскопии. ЯМР Биомед 1997; 10: 394–410. [PubMed] [Google Scholar]62. Прюсман КП, Вейгер М, Шайдеггер МБ, Boesiger P. SENSE: кодирование чувствительности для быстрой МРТ. Магн Резон Мед 1999; 42: 952–962. [PubMed] [Google Scholar]63. Грисволд М.А., Джейкоб ПМ, Хайдеманн Р.М. и соавт. Обобщенная автокалибровка частично параллельной (GRAPPA). Магн Резон Мед 2002;47:1202–1210.[PubMed] [Google Scholar]64. Блаймер М, Брейер Ф, Мюллер М. и соавт. SMASH, SENSE, PILS, GRAPPA. Резонансная визуализация с верхним магнитным полем 2004; 15: 223–236. [PubMed] [Google Scholar]65. Визингер Ф, Босигер П, Прюсман КП. Электродинамика и предельное отношение сигнал/шум в параллельной МРТ визуализации. Магн Резон Мед 2004; 52: 376–390. [PubMed] [Google Scholar]66. Вайдья М.В., Содиксон Д.К., Латтанзи Р. Приближение к предельному собственному SNR в однородном сферическом образце с конечными массивами петлевых катушек. Концепции Magn Reson Часть B 2015;44:53–65.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]67. Кинг СБ, Вароси СМ, Дуэнсинг ГР. Оптимальное сжатие данных SNR в аппаратном обеспечении с использованием массива собственных катушек. Магн Резон Мед 2010;63:1346–1356. [PubMed] [Google Scholar]68. Робсон ПМ, Грант АК, Мадхурантакам А.Дж. и соавт. Комплексная количественная оценка отношения сигнал-шум и g-фактора для реконструкций параллельных изображений на основе изображений и k-пространства. Магн Резон Мед 2008; 60: 895–907. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]69. Шмитт М, Потхаст А, Сосновик Д.Е., и соавт.128-канальная кардиальная катушка только для приема для высокоускоренной МРТ сердца при 3 Тесла. Магн Резон Мед 2008; 59: 1431–1439. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

70. Грубер Б, Хендрикс АД, Alborahal CBS и др. Потенциал 256-канальной матричной катушки только для приема для ускоренной визуализации сердца при 3T. В: Протокол 25-го ежегодного собрания ISMRM, Гонолулу; 2017.

72. Рейковский А, Сэйлор С, Дуэнсинг ГР. Нужна ли нам развязка предварительного усилителя. В: Proc 19th Annual Meeting ISMRM, Montreal; 2011.

73. Кригл Р, Джинефри Дж.С., Пуарье-Кино М. и соавт. Новый метод индуктивной развязки для гибких приемопередающих решеток монолитных резонаторов линии передачи. Магн Резон Мед 2015;73:1669–1681. [PubMed] [Google Scholar]74. Перселл Э.М., Торри ХК, Фунт РВ. Резонансное поглощение ядерными магнитными моментами в твердом теле. Физическая версия 1946; 37–38. [Google Академия] 75. Блох Ф, Хансен В.В., Паккард М. Эксперимент по ядерной индукции. Физическая версия 1946; 474–485. [Google Академия]76. Хуршкайнен А.А., Державская Т.А., Глыбовский С.Б. и соавт.Развязка элементов массивов дипольных тел 7 Тл метаповерхностными структурами EBG: экспериментальная проверка. Джей Магн Резон 2016; 269:87–96. [PubMed] [Google Scholar]

77. Калоз С, Реннингс А. Обзор резонансных антенн из метаматериала. В: 3-я Европейская конференция по антеннам и распространению, Берлин, Германия, 2009 г.

78. Сиддики М.Ф., Реза А.В., Шафик А, Омер Х, Kanesan J. Реализация на ПЛИС реконструкции SENSE в реальном времени с использованием чувствительности предварительного сканирования и Emaps. Магнитно-резонансная визуализация 2017;44:82–91.[PubMed] [Google Scholar]

79. Хайд О, Вестер М, Корк П, Халберт П, Хьюиш ДВ. Перерезание шнура — Беспроводные катушки для МРТ. В: Proc 17th Annual Meeting ISMRM, Гонолулу; 2009.

80. Скотт Г, Ю К. Беспроводные транспондеры для радиочастотных катушек: системные вопросы. В: Proc 13th Annual Meeting ISMRM, Miami; 2005.

81. Малко Ю.А., Макклис ЕС, Браун ИФ, Дэвис ПК, Хоффман Дж. Гибкая ртутная поверхностная катушка для МРТ. Am J Нейрорадиол 1986; 7: 246–247. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]83.Нордмейер-Масснер Дж.А., Де Занче Н., Прюсман КП. Растягивающиеся массивы катушек: применение для визуализации коленного сустава при различных углах сгибания. Магн Резон Мед 2012; 67: 872–879. [PubMed] [Google Scholar]

84. Грубер Б, Зинк С. Анатомически адаптивные локальные катушки для МРТ — оценка растягиваемых антенн при 1,5 Тл. В: Proc 24th Annual Meeting ISMRM, Singapore; 2016.

85. Венук РД, Харгривз Б.А., Золото GE, Конолли С.М., Скотт ГК. Автоматическая настройка катушек гибких интервенционных радиоприемников.Магн Резон Мед 2005; 54: 983–993. [PubMed] [Google Scholar]

86. Рейковский А, Duensing R. Беспроводной цифровой конденсаторный модуль для настройки массивов приемных катушек. В: Протокол 22-го ежегодного собрания ISMRM, Милан; 2014.

87. Стормонт Р, Робб Ф, Линдси С. и др. Переосмысление технологии гибких катушек. http://GESIGNAPULSE.com 2017;69–71. 88. Бруннер Д.О., Де Занче Н., Фрёлих Дж., Паска Ж, Прюсман КП. Ядерный магнитный резонанс бегущей волны. Природа 2009; 457:994–998. [PubMed] [Google Scholar]89.Уиггинс ГК, Браун Р, Лакшманан К., Высокоэффективные РЧ-катушки для МРТ с 23Na: исследования головного мозга и опорно-двигательного аппарата. ЯМР Биомед 2016;29:96–106. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]90. Кумар А, Велти Д, Эрнст РР. ЯМР Фурье-зевгматография. Джей Магн Резон 1975; 18: 69–83. [Google Академия]92. Уэбб АГ. Радиочастотные микрокатушки для магнитно-резонансной томографии и спектроскопии. Джей Магн Резон 2013;229:55–60. [PubMed] [Google Scholar]

93. Siemens Healthcare GmbH, Магниты, спины и резонансы — введение в основы магнитного резонанса, Эрланген: Siemens Healthcare GmbH, 2015, 160.

94. Уиггинс ГК, Триантафиллу С, Potthast A, et al. 32-канальная 3-канальная головная катушка с фазированной решеткой Tesla только для приема с геометрией элемента футбольного мяча. Магн Резон Мед 2006; 56: 216–223. [PubMed] [Google Scholar]95. Стокманн Дж.П., Витцель Т, Кейл Б. и др. 32-канальный комбинированный RF и B0 Shim Array для 3T-визуализации головного мозга. Магн Резон Мед 2016;75:441–451. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

96. Грубер Б, Кейл Б, Витцель Т, Нумменмаа А, Уолд ЛЛ. 60-канальный массив ex-vivo срезов головного мозга для 3T-визуализации.В: Протокол 22-го ежегодного собрания ISMRM, Милан; 2014.

97. Доти ФД, Энцмингер Г, компакт-диск Хаук. Устойчивые к ошибкам катушки RF litz для ЯМР/МРТ. Джей Магн Резон 1999; 140:17–31. [PubMed] [Google Scholar]

98. Эцель Р, Цао Х, Меккауи С. и др. Оптимизация конструкции и оценка 64-канальной катушки с сердечным массивом при 3T. В: Протокол 23-го ежегодного собрания ISMRM, Торонто; 2015.

99. Юнге С. Криогенные и сверхпроводящие катушки для МРТ. еМагРес, 2012;1. [Google Scholar]

Флавоноид 4,4′-диметоксихалкон способствует долголетию, зависящему от аутофагии, у разных видов

Реагенты

Следующие реагенты были приобретены у указанных поставщиков: аннексин V с маркировкой FITC (Roche Applied Science [11828681001]), дигидроэтидий (DHE, Sigma-Aldrich, [D7008]), йодид пропидия (PI, Sigma-Aldrich [P4170]), 4,4′-диметоксихалкон (DMC; ABCR, [AB179040]; Extrasynthese, [1295]; Sigma-Aldrich, [S617237]), рапамицин (LC Laboratories, [R-5000]), ресвератрол (Sigma-Aldrich [R5010]).Для первоначального скрининга дрожжей все флавоноиды (включая 4,4′-диметоксихалкон) были приобретены у Extrasynthese; полный список, включая название, подкласс и артикул каждого флавоноида, см. в дополнительной таблице 1. Исходные растворы флавоноидов всегда были свежеприготовлены в ДМСО перед обработкой. Ацетонитрил (Chromasolv), муравьиная кислота (puriss), этилацетат (Chromasolv) были приобретены у Sigma Aldrich (Сент-Луис, США). Воду очищали с помощью системы MilliQ (<18,2 МОм·см, Merck, Дармштадт, Германия).

Дрожжевые штаммы и плазмиды

эксперименты проводились в BY 4742 (Matα HI3 δ 1 LEU2 δ 0 LY2 δ 0 URA3 δ 0 ) и соответствующие нулевые мутанты, полученные из Euroscarf или (дополнительная таблица 3), как описано ниже. Для мониторинга внутриклеточной локализации эндогенного Atg8 использовали ранее описанный штамм, экспрессирующий слитый белок EGFP-Atg8 52 . Экспрессию белка Atg определяли с использованием хромосомных 6(HA)-меченых штаммов, полученных с использованием pYM17 в качестве матрицы 53 .Все штаммы выращивали на среде SC, содержащей 0,17 % азотистого основания дрожжей (BD Diagnostics, Швехат, Австрия), 0,5 % (NH 4 ) 2 SO 4 , 30 мг/л всех аминокислот (кроме 80 мг /л гистидина и 200 мг/л лейцина), 30 мг/л аденина и 320 мг/л урацила, с 2% глюкозы (SCD). Для экспериментов по комплементации с Gln3, то есть для эписомальной экспрессии Gln3, клетки выращивали на SCD, как описано ниже, и после обработки флавоноидом добавляли галактозу до конечной концентрации 0.1%, чтобы вызвать экспрессию. Успешная экспрессия была подтверждена с помощью вестерн-блоттинга; обратите внимание, что полученная двойная полоса (дополнительный рисунок 8f) характерна для Gln3 54 .

Эксперименты по хронологическому старению дрожжей

Эксперименты по хронологическому старению проводили в 96-луночных планшетах (Bel-Art Products, США), закрытых газопроницаемыми адгезивными мембранами (Excel Scientific) и крышками. Поэтому 500 мкл свежей среды инокулировали ночными культурами из клеточного материала 4-дневной инкубации планшета YEPD до ОП 600 , равной 0.1 (~1,10 6 клеток мл –1 ). Таким образом, лунки на внешних краях глубоколуночных планшетов не инокулировали, так как они склонны к высыханию в процессе старения; вместо этого они были загружены водой. Затем клетки выращивали до OD 600 ~0,2 и впоследствии добавляли либо указанную концентрацию свежеразбавленного ДМСО флавоноида, либо только ДМСО (контроль), оба в конечной концентрации 0,2% ДМСО. Отбирали аликвоты для выполнения различных окрашиваний жизнеспособности (PI, DHE, AnnexinV/PI), тестов на выживаемость (посев, способность к возобновлению роста) 13,55 и/или анализов аутофагии (EGFP-Atg8, ALP) в указанные моменты времени ( Инжир.1а).

Для первоначального скрининга дрожжей каждый флавоноид добавляли в концентрации 50 мкМ. После идентификации DMC как основного цитопротекторного средства мы определили оптимальную дозу для лечения дрожжей при 100 мкМ, по крайней мере, в применяемых условиях. Это была самая низкая концентрация, оказывающая самый высокий спасительный эффект (дополнительный рисунок 2a).

Одной из основных причин хронологического старения дрожжей может быть чрезмерное производство уксусной кислоты 56 . Следовательно, продолжительность жизни дрожжей можно продлить путем подщелачивания среды 52 .Следует отметить, что обработка DMC не изменила pH среды (дополнительный рисунок 2f), демонстрируя, что цитопротекторные эффекты DMC при хронологическом старении дрожжей не зависят от pH.

Если не указано иное, репрезентативные эксперименты по старению показаны как минимум с шестью независимыми биологическими повторами старения одновременно. Всего эксперименты проводились не менее трех раз с одинаковым результатом, за исключением процедуры скрининга, когда каждый флавоноид тестировался в трех-шести независимых образцах для каждого эксперимента со старением.

Анализ маркеров гибели клеток в дрожжах

Для начального скрининга дрожжей окрашивание PI (некроз) и DHE (супероксид анион O 2 ) проводили следующим образом: ~1 ×  10 7 клеток собирали центрифугированием в течение 5 минут при 2700 × г и окрашивали в течение 5 минут йодидом пропидия (100 нг/мл в PBS, pH 7,4) или дигидроэтидием (2,5 мкг/мл в PBS, pH 7,4) соответственно. Клетки снова осаждали в течение 5 мин при 2700 × г и ресуспендировали в PBS.Относительные единицы флуоресценции определяли с использованием флуоресцентного ридера (Tecan, GeniusPRO) и нормализовали к OD 600 каждого образца. Затем рассчитывали площадь под кривой (AUC) для всех контролируемых дней в течение хронологического старения и вычисляли балл Z для результатов с PI и DHE соответственно. Результаты, полученные в этих высокопроизводительных анализах, положительно коррелируют с соответствующими низкомасштабными экспериментами (дополнительный рисунок 1a–c). Следует отметить, что неокрашенный образец каждой лунки был протестирован на 1-й день хронологического старения, чтобы учесть возможные внутренние флуоресцентные свойства любого данного флавоноида, которые могут мешать нашим анализам на основе флуоресценции.Для анализа жизнеспособности с использованием способности роста, которая ранее использовалась для определения жизнеспособности, связанной со старением 41,57 , аликвоты (9 мкл) были взяты на 3-й день хронологического старения для инокуляции 171 мкл свежей среды SCD в 96-луночные тарелки. Культуры (всего 180 мкл) выращивали при 28°C, 1000 об/мин (скорость двигателя) и измеряли OD 600 в момент инокуляции и через 10 ч после этого с помощью планшет-ридера (Tecan, GeniusPRO). Рост определяли как разницу между измеренной ОП 600 во время инокуляции и через 10 часов роста [ОП 600 (10 ч) — ОП 600 (инокуляция) ], а затем нормализовали к обработанному ДМСО контроль; наконец, была вычислена оценка Z .Как и в других высокопроизводительных анализах (см. Выше), была установлена ​​положительная корреляция между способностью к росту и жизнеспособностью (дополнительный рисунок 1b).

Анализы на апоптоз/некроз (совместное окрашивание аннексином V/PI) после обработки DMC количественно определяли с помощью проточной цитометрии (BD LSRII Fortessa, BD Biosciences). Вкратце, ~1 ×  10 7 клеток собирали центрифугированием в течение 5 мин при 2700 ×  г и промывали один раз водой и один раз буфером B + S (35 мМ калий-фосфатный буфер, pH 6.8, 0,5 мМ MgCl 2 , 1,2 М сорбита). Для получения сферопластов клетки ресуспендировали в 330 мкл буфера B + S, добавляли 15 мкл глюкуронидазы/арилсульфатазы (Sigma-Aldrich, [BGALA-RO]) и 3 мкл литиказы (1000 ЕД/мл, Sigma-Aldrich [L2524]). и клетки инкубировали при 28 °C в течение 30 мин. Сферопласты осаждали при 500 g в течение 2 мин и тщательно промывали один раз буфером B + 0,6 М сорбита. Затем сферопласты ресуспендировали в 30 мкл буфера для инкубации (10 мМ HEPES pH 7,4, 140 мМ NaCl, 5 мМ CaCl 2 , 0.6 М сорбита) и окрашивали в течение 20 мин, добавляя 3 мкл AnnexinV-FLUOS (Sigma-Aldrich [11828681001]) и 3 мкл PI (100 мкг/мл). Для проточной цитометрии с использованием программного обеспечения BD FACSDiva (BD Biosciences) оценивали в общей сложности 30 000 клеток на образец. Клетки, накапливающие АФК, количественно оценивали с помощью окрашивания DHE (см. выше) и последующей проточной цитометрии и анализа 30 000 клеток. Для посева на клоногенную выживаемость количество клеток в культурах, обработанных DMC, и в контролях измеряли с помощью счетчика клеток CASY (Schärfe System GmbH), 500 клеток высевали на чашки с агаром YEPD и инкубировали в течение двух дней при 28 °C, чтобы обеспечить образование колоний.Колониеобразующие единицы (КОЕ) анализировали с помощью автоматического счетчика колоний (LemnaTech). Для каждого штамма КОЕ, определенные для контрольных культур, принимали за 100%, и выживаемость соответствующих культур, обработанных DMC, рассчитывали относительно соответствующей контрольной культуры.

Конструирование плазмид и нокаут-генерация дрожжей

Штаммы с одинарными и двойными мутациями были получены в соответствии с описанным методом либо с использованием ген-специфичной кассеты с нокаутом URA3, амплифицированной с помощью ПЦР с использованием pUG72 в качестве матрицы 58 , либо с использованием natNT2 или кассеты hphNT1 pFA6a–natNT2 и pFA6a–hphNT1 соответственно 53 .Корректность делеции гена подтверждали с помощью ПЦР с соответствующими контрольными праймерами и дополнительно проверяли на устойчивые ауксотрофии. Все использованные праймеры перечислены в дополнительной таблице 4. Плазмида [pESC-His-6(HA)] была сконструирована путем расщепления Sac I/ Cla I и лигирования фрагмента 6(HA), амплифицированного из pYM17, с использованием праймеров. ClaI_6HA_f и SacI_6HA_r. GLN3 амплифицировали из геномной ДНК из BY4742 с использованием праймеров GLN3_F (NotI) и GLN3_R (ClaI) и клонировали в полученный вектор с использованием сайтов рестрикции Not I/ Cla I (см. Дополнительную таблицу 5).Примечательно, что по крайней мере три разных клона каждого полученного мутанта были протестированы на сходную реакцию на окрашивание PI во время старения, чтобы исключить клоногенную изменчивость.

Измерения аутофагии дрожжей

Аутофагию исследовали в соответствии с опубликованными методами, определяя либо высвобождение GFP с помощью иммуноблоттинга (см. раздел «Иммуноблотинг»), либо вакуолярную локализацию Atg8 с помощью флуоресцентной микроскопии в клетках, экспрессирующих слитый белок EGFP-Atg8 52 . Кроме того, активность ALP 16 оценивали с использованием соответствующих клеток Pho8ΔN60, трансформированных и отобранных для стабильной вставки pTN9 Hind III фрагмент 59 : ~3 × 10 7 клеток собирали центрифугированием при 2700 × 5 в течение 5 мин и один раз промыли 500 мкл H 2 O.Клетки ресуспендировали в 200 мкл ледяного буфера для анализа (250 мМ Трис/HCl pH 9,0, 10 мМ MgSO 4 , 10 мкМ ZnSO 4 ) и переносили в предварительно охлажденную реакционную пробирку со 100 мкл промытого кислотой стекла. бисер. Клетки разрушали на бисерной мельнице (Mini-Beadbeater) в предварительно охлажденном металлическом штативе для реакционных пробирок в течение 3 × 45 с с интервалами в 30 с между ними. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 10 000 ×  g при 4 °C в течение 10 минут, а надосадочную жидкость осторожно переносили в свежие предварительно охлажденные пробирки.Концентрацию белка определяли с помощью анализа белка Брэдфорда (Bio-Rad [5000006]). Экстракты клеток, соответствующие 1–1,5 мкг белка, добавляли к конечному объему 550 мкл буфера для анализа (комнатная температура) и начинали реакцию добавлением 50 мкл α-нафтилфосфата (55 мМ в буфере для анализа, рН 9,0). Через 20 мин при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 200 мкл останавливающего буфера (2 М глицин/NaOH, рН 11,0). Двести микролитров реакционной смеси измеряли в черных 96-луночных планшетах в планшет-ридере (Tecan, GeniusPRO) при экс: 345 нм, эм: 472 нм.Чтобы скорректировать внутреннюю (фоновую) активность ALP, одновременно обрабатывали контрольные культуры (без pTN9) и вычитали активность ALP.

Активность TORC1 дрожжей

Клетки выращивали до OD 600 0,2 и обрабатывали либо 100 мкМ DMC, либо 40 нМ рапамицином в течение 6 часов. Собирали три единицы OD 600 и экстрагировали белки (см. раздел «Иммуноблоттинг»). Фосфорилирование Rps6 по серину 232 и 233 было обнаружено с помощью антитела 60 к рибосомальному белку фосфо-S6 (Ser235/236) (Cell Signaling [#2211 S], кролик, 1:1000), а уровни фосфорилирования нормализованы по отношению к GAPDH.В качестве контроля, стационарные культуры дикого типа и штаммы rps6aS232A, S233A Δ rps6b (любезный подарок доктора Тарека Мустафы) были повторно обработаны свежей средой SCD в течение 1 часа перед сбором урожая.

Активация промотора MEP2 дрожжей

Зависимую от промотора MEP2 экспрессию lacZ определяли с помощью анализа бета-галактозидазы. В указанные моменты времени собирали 1,5 ОП 600 единиц, один раз промывали водой и лизировали в течение 30 с в 380 мкл Z-буфера (100 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7.0, 10 мМ KCl, 1 мМ MgSO 4 , 40 мМ 2-мекаптоэтанола) с 50 мкл 0,1% SDS и 50 мкл CHCl 3 с использованием бисерной мельницы (Mini-Beadbeater). После добавления 50 мкл 4 мг/мл о-нитрофенилгалактозида (Serva) суспензии инкубировали при комнатной температуре и останавливали добавлением 125 мкл 1 М Na 2 CO 3 , когда суспензии становились желтыми. Образцы центрифугировали в течение 5 минут при 2700× g и измеряли поглощение супернатанта при 450 нм. Для оценки доли живых клеток аликвоты культур окрашивали PI и измеряли гибель клеток с помощью проточной цитометрии.Единицы Миллера/фракцию живых рассчитывали по формуле [1000x A 450 ]/[объем в мл * OD 600 * время инкубации в мин * фракция PI-отрицательных клеток].

Определение изменений метаболизма дрожжей

Дрожжевые клетки, культивированные в планшетах с глубокими лунками, обрабатывали 100 мкМ ДМЦ (или 0,2% ДМСО в качестве контроля) в течение 72 часов. Для каждой повторности 5 мл культуры быстро собирали микрофильтрацией с использованием 0,45 мкм PVDF-фильтров, немедленно промывали 10 мл сверхчистой воды, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80°C до экстракции.Экстракцию этанолом (ВЕ) кипячением проводили с помощью 2,5 мл предварительно нагретого буфера ВЕ (75% об./об. этанола, 15 мМ ацетата аммония, рН 7,5) в течение 2 мин при 96°С на водяной бане с коротким встряхиванием каждые 30 с. После экстракции остатки клеток осаждали центрифугированием в течение 3 мин при 2500 ×  г при –20 °С, супернатант концентрировали азотным испарением и подвергали сухой заморозке. Образцы растворяли в 100 мкл LCMS-H 2 O, центрифугировали при 17000× g в течение 5 минут, а супернатант использовали для ЖХ/МС.

Все образцы были измерены с помощью системы ЖХ/МС от Thermo Fisher ScientificTM. Для разделения соединений перед масс-спектрометрическим детектированием с помощью системы ExactiveTM Orbitrap использовали установку ВЭЖХ Dionex Ultimate 3000, оснащенную аналитической колонкой Atlantis T3 C18 (Waters, США). Для разделения метаболитов использовали метод обращенно-фазовой ВЭЖХ с ионным паром (адаптировано из ссылки 61 ). В качестве ион-сопрягающего агента использовали трибутиламин. Применяли 40-минутный градиент и 2-пропанол и водную фазу (5% метанол (об/об), 10 мМ трибутиламин, 15 мМ уксусная кислота, рН 4.95) использовались в качестве элюента A и B соответственно (дополнительная таблица 6). Объем инъекции составлял 10 мкл на образец, и использовалась инъекционная петля объемом 20 мкл.

Отрицательная ионизация метаболитов была проведена с помощью ионизации электрораспылением с подогревом (HESI) перед масс-спектрометрическим анализом. Для обнаружения аналитов в режиме онлайн использовалось полное сканирование всех масс от 70 до 1100  m/z с разрешением (R) 50000 (при m/z 200).

Сбор данных ЖХ/МС проводился с помощью программного обеспечения Xcalibur (версия 2.2 SP1, Thermo Fisher Scientific (Waltham, США)). Необработанные данные были преобразованы в mzXML с помощью msConvert (ProteoWizard Toolkit v3.0.5), а метаболиты были подвергнуты целевому поиску с использованием инструмента собственной разработки PeakScout 62 . Чистые аналиты анализировали на той же системе для получения точного эталонного времени удерживания и спектров фрагментации. Необработанные данные дополнительно оценивали с помощью Microsoft Excel 2010. Для кластеризации метаболитов площади метаболитов нормализовали к кумулятивному сигналу всех площадей метаболитов за каждый день (средний сигнал каждого метаболита по всем образцам был установлен равным 1) и преобразовывали log2.Анализ PCA проводили с использованием инструмента Genesis 1.7.7 (Bioinformatics, Технический университет Граца). Полный набор данных доступен в дополнительном файле данных 1.

Определение протеома дрожжей с использованием SILAC

Эксперименты SILAC (метка стабильными изотопами аминокислотами в клеточной культуре) проводились в соответствии с ранее опубликованными протоколами 17 . Вкратце, белки из меченых дрожжевых клеток (Lys0 + Arg0 или Lys4 + Arg10), обработанных 100 мкМ DMC в течение 24 или 72 часов, экстрагировали путем разрушения стеклянных шариков в буфере P (50 мМ Трис/HCl, pH 7.4, 1% Triton X-100, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА), содержащий полный® коктейль ингибиторов протеазы (Roche), 1 мМ PMSF (Sigma) и ингибиторы HDAC трихостатин А (2 мкМ, Sigma) и никотинамид (30 мМ, Сигма). Концентрацию белка определяли с помощью анализа белка Bio-Rad (Bio-Rad), и по 500 мкг каждого тяжелого и легкого экстрактов смешивали и хранили при -80 °C до измерения МС. Для подготовки образцов MS зонды восстанавливали с помощью 1 мМ DTT (Sigma-Aldrich) и алкилировали с использованием 5,5 мМ йодацетамида (Sigma-Aldrich).Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и расщепляли в геле с использованием трипсина (Promega) при 37 °C в течение ночи, а полученные смеси пептидов обрабатывали на наконечниках STAGE 63 .

Масс-спектрометрические измерения проводились на масс-спектрометре LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific, Бремен, Германия), соединенном с нанопоточной ВЭЖХ Agilent 1200 (Agilent Technologies GmbH, Вальдброн, Германия). Наконечники колонок для ВЭЖХ (плавленый кварц) с внутренним диаметром 75 мкм (New Objective, Woburn, MA, USA) были самостоятельно заполнены Reprosil-Pur 120 ODS-3 (Dr.Maisch, Аммербух, Германия) до 20 см в длину. Образцы наносили непосредственно на колонку без предварительной колонки. Градиент А [0,5 % уксусной кислоты (высокой чистоты, LGC Promochem, Везель, Германия) в воде (градиент для ВЭЖХ, Mallinckrodt Baker BV, Девентер, Нидерланды)] и В [0,5 % уксусной кислоты в 80 % ACN (LC- MS класс, Вако, Германия) в воде] с увеличением органической доли использовали для разделения пептидов (загрузка образца 2% B; линейное изменение разделения: от 10% до 30% B в течение 80 мин). Скорость потока составляла 250 нл/мин, а для нанесения образца 500 нл/мин.Масс-спектрометр работал в режиме зависимости от данных и автоматически переключался между МС (макс. 1 × 10 6 ионов) и МС/МС. За каждым МС-сканированием следовало максимум пять МС-МС-сканирований в линейной ионной ловушке с использованием нормализованной энергии столкновения 35 % и целевого значения 5000. исключен из-за фрагментации. Диапазон масс для MS составлял m/z  = 370 до 2000. Разрешение было установлено на 60000.Масс-спектрометрические параметры были следующими: напряжение распыления 2,3 кВ; нет оболочки и вспомогательного газового потока; температура ионообменной трубки 125 °C.

Файлы необработанных данных МС были загружены в программное обеспечение MaxQuant версии 1.4.1.2 64 , которое выполняет обнаружение пиков, количественную оценку без меток и создает списки пиков пептидов с поправкой на массовые ошибки с использованием следующих параметров: карбамидометилцистеин был установлен как фиксированный модификация, окисление метионина и амино-концевое ацетилирование белка были установлены как переменные модификации.Допускались три пропуска расщепления, специфичность фермента была трипсин/P, а допуск МС/МС был установлен на 0,5 Да. Андромеда провела поиск списков пиков для идентификации пептидов с использованием базы данных Uniprot Saccharomyces cerevisiae , содержащей общие загрязнители, такие как кератины и ферменты, используемые для расщепления в геле. Списки пептидов в дальнейшем использовались MaxQuant для идентификации и сравнительного количественного определения белков с использованием следующих параметров: коэффициенты ложного обнаружения пептидов и белков были установлены на 0.01, максимальная вероятность апостериорной ошибки (PEP) для пептида была установлена ​​на 1, минимальная длина пептида была установлена ​​на 7, PEP была основана на показателе Andromeda, минимальное количество пептидов для идентификации и количественного определения белков было установлено на единицу и должно быть уникальным, и идентифицированные белки повторно определяли количественно.

Для анализа обогащения использовалось программное обеспечение DAVID Bioinformatics Resources 6.7, NIAID/NIH [https://david-d.ncifcrf.gov/], с использованием следующих настроек: кластеризация функциональных аннотаций (GOTERM_BP_FAT), средняя строгость, сходство Каппа (наложение терминов: 3, порог подобия: 0.5), классификация (начальное членство в группе: 3, конечное членство в группе: 3, порог множественного сцепления: 0,5), порог обогащения (EASE: 1,0). Эталонный протеом был установлен для всех измеренных белков в данный момент времени. Для расчета значения P использовалась поправка Бенджамини. Полный набор данных доступен в дополнительном файле данных 2.

Данные протеомики масс-спектрометрии были переданы в Консорциум ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE 65 с идентификатором набора данных PXD012108 и названием проекта: «Флавоноид 4,4». ‘-диметоксихалкон способствует долголетию, зависящему от аутофагии, у разных видов».

Штаммы C. elegans и техническое обслуживание

Мы придерживались стандартных условий культивирования нематод 66 . Температуру выращивания нематод поддерживали на уровне 20°C, а животных поддерживали при 20°C на агаровой среде для роста нематод (NGM) с добавлением Escherichia coli (OP50 или трансформированный HT115). Мы использовали штаммы N2 (дикий тип) и Mh5799:elt-1(ku491) IV для анализа продолжительности жизни и штамм VK1093:vkEx1093 [P nhx-2 ::mCherry::lgg-1] для измерения аутофагии.

Анализы продолжительности жизни C. elegans

Обработку DMC C. elegans проводили на чашках с агаром NGM непрерывно в течение всей жизни, начиная с личинок L1, если не указано иное. Все чашки с агаром были приготовлены из одной и той же партии агара NGM и засеяны высушенными бактериями (OP50), которые предварительно были убиты УФ-излучением, чтобы избежать вмешательства в метаболическую активность ксенобиотиков Escherichia coli . ДМС (41.6  мкМ) или эквивалентный объем растворителя ДМСО наносили на высушенные бактерии в лечебных и контрольных чашках соответственно. Пластины с пятнами высушивали в течение ночи при комнатной температуре перед использованием. Процедуру повторяли каждый раз, когда червей переносили на свежие чашки. Для экспериментов по продолжительности жизни РНКи кормление РНКи начинали на личиночной стадии L4. Червей помещали на чашки с NGM, содержащие 0,5–1  мМ IPTG, и засевали бактериями HT115, трансформированными либо вектором pL4440, либо тестируемой плазмидой RNAi.Трансформированные дцРНК бактерии atg-5(Y71G12B.12), bec-1 (T19E7.3) и elt-1 (W09C2.1) были получены из библиотеки Ahringer C. elegans RNAi 67. Все бактериальные клоны дцРНК использовали в концентрации 0,9 OD, разбавленной пустыми бактериями, содержащими вектор, в соответствии с предыдущими исследованиями 68 .

Анализ выживаемости начинали с момента вылупления, если не указано иное, и проводили при 20 °C с использованием синхронных популяций 60/80 животных на условие.Животных учитывали как мертвых или живых и переносили каждый день на свежие чашки в течение фертильного периода, а затем через день или каждые 3 дня до гибели. Черви считались мертвыми, когда они переставали качать кровь из глотки и реагировали на прикосновение. Черви, погибшие из-за внутреннего мешкообразования, высыхания из-за ползания по краю пластин или экструзии гонад, оценивались как цензурированные. Эти животные были включены в анализ продолжительности жизни вплоть до цензуры. Обратите внимание, что из-за довольно высокой биологической дисперсии, связанной с экспериментами по старению, повторные анализы выживания показаны как отдельные эксперименты; подробности см. в дополнительной таблице 2.

C. elegans измерения аутофагии

Для количественной оценки индукции аутофагии использовали штамм VK1093:vkEx1093 [P nhx-2 ::mCherry::lgg-1]. Червей обрабатывали 41,6 мкМ DMC из стадии L1 в течение 48 часов. Для экспериментов по подавлению червей переносили как L4 на соответствующие чашки (контроль и соответствующий RNAi ± DMC). После 24 часов молчания (взрослые) черви были обнаружены с помощью флуоресцентного микроскопа.

Использование ImageJ, [http://imagej.nih.gov/ij/], изображенные черви были отобраны вручную и подсчитано количество очагов с использованием автоматизированной функции ImageJ «Анализ частиц» на скорректированных изображениях. Чтобы избежать артефактов, все изображения были получены и настроены с использованием одних и тех же настроек.

Штаммы D. melanogaster и среда

Мы использовали Drosophila melanogaster w 1118 или Atg7 -/- мух. Последние были получены путем скрещивания девственных особей Atg7 d77/+ с самцами мух Atg7 d14/+ 69 , оба изогенизированы до w 1118 .Эксперименты на мухах проводились с использованием двух разных сред: (i) CSY, содержащей 1 % агара (BD), 1 % дрожжевого экстракта Bacto™ (BD), 5 % сахарозы (Roth), 0,8 % кукурузной муки, 0,03 % (об./об.) пропионовой кислоты и 0,3% (об./об.) раствора 4-гидроксибензоата (Sigma-Aldrich, 100  г/л в 100% этаноле) или (ii) кукурузно-мелассовой среды Bloomington, содержащей 0,8% агара, 0,75% сухих пекарских дрожжей, 0,83 % соевой муки, 8,5 % сиропа сахарной свеклы, 6,7 % кукурузной муки, 0,0525 % (об./об.) пропионовой кислоты и 0,42 % раствора 4-гидроксибензоата (310  г/л в 100 % этаноле).Для обеих сред пропионовую кислоту и 4-гидроксибензоат добавляли, когда пища охлаждалась до 60 °C. ДМК добавляли при 40 °С в конечной концентрации 200 мкМ и концентрации ДМСО 0,1%. Пищу хранили при температуре 4 °C не более 1 недели.

D. melanogaster Анализы продолжительности жизни

Мух выращивали в стандартных широких пластиковых флаконах с пробками и высиживали в течение трех дней, пока их не собирали, не оставляли для спаривания в течение 24 часов, затем определяли пол под наркозом CO 2 и сортировали на порции по 20 особей. летает с максимальным общим временем анестезии 6  мин.Для иммунофлуоресценции мозга мух анестезировали не более чем на 2 мин. На CSY мух переводили на свежий корм три раза в неделю, на кукурузно-меласную среду Bloomington — через день. Случайно сбежавшие мухи подвергались цензуре. Все эксперименты по старению проводились в климатических камерах при температуре 25 °C и влажности 70% с циклом свет/темнота 12 ч/12ч. Обратите внимание, что из-за довольно высокой биологической дисперсии, связанной с экспериментами по старению, повторные анализы выживания показаны как отдельные эксперименты; подробности см. в дополнительной таблице 2.

Анализ потребления пищи мухами

Пищевое поведение определяли с помощью анализа капиллярного питания. Вкратце, пластиковые флаконы для мух заполняли 3 мл 1% агара и с помощью горячего шприца в стенку флакона вводили три небольших отверстия для воздуха. Флаконы закрывали парафильмом (Bemis NA) и резиновыми крышками, содержащими два дополнительных отверстия для вентиляции и два отверстия для стеклянных капилляров объемом 5 мкл (Hirschmann). Четыре самки мух на флакон приучали к процедуре кормления в течение 2 дней. Затем кормление тестируемым кормом (2.5% дрожжевого экстракта, 2,5% сахарозы и 200 мкМ ДМК или соответствующее количество ДМСО) контролировали в течение трех последовательных 10-15-часовых интервалов. Были проанализированы пять независимых флаконов для каждого состояния, и пищевое поведение было выражено как мкл корма*муха -1 *12 ч -1 .

Анализ плодовитости мух

Мух (возрастом 1–4 дня) пересаживали в новые флаконы и оставляли для спаривания на 48 ч, а затем разделяли их на порции по 10 самок под наркозом CO 2 . Мух состаривали на корме Bloomington, содержащем 200 мкМ DMC, или на контрольном корме.В указанные моменты времени мух переводили на свежий корм на 16 ч, после чего подсчитывали личинок и яйца первых возрастов. Всего было проанализировано шесть независимых флаконов для каждого состояния.

Измерения аутофагии мух

w 1118 мух выращивали на среде Bloomington из кукурузной муки и мелассы, содержащей 0,47% агара, 0,75% сухих пекарских дрожжей, 0,83% соевой муки, 8,5% сиропа сахарной свеклы, 6,7% кукурузной муки, 0,0525% (об./об.) пропионовой кислоты и 0,42% раствора 4-гидроксибензоата (310  г/л в 100% этаноле) и оставляли для вылупления на 2 дня.Затем мух переносили в новые флаконы и оставляли для спаривания на 24 часа. Части 20 самок мух сортировали под анестезией CO 2 с максимальной анестезией 2 мин и переносили в небольшие флаконы, содержащие контрольный корм (0,1% ДМСО) или корм с добавлением 200 мкМ ДМК, оба содержат 1% агара. Мух переносили в свежие флаконы через день и выдерживали в течение 3 (молодые) или 30 дней (старые) при 25°С и влажности 70% с циклом свет/темнота 12 ч/12 ч.

Мозг 30-дневных самок мух препарировали и собирали в охлажденном на льду гемолимфоподобном солевом растворе (HL-3).После фиксации в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,7% Triton X-100 (PBS-T) и 4% параформальдегида, в течение 30 мин и нескольких стадий промывки в PBS-T сайты связывания неспецифических антител блокировали 10% нормальной козьей сывороткой. Мозг инкубировали с поликлональным антителом против Ref(2)P (Кролик, подарок доктора Габора Юхаса, 1:8000) в течение 48 ч, шесть раз промывали и затем инкубировали с соответствующим вторичным антителом, связанным с Alexa 488 (Кролик). , Invitrogen, [#A11034], 1:500) еще на 16 часов.11–12 образцов мозга каждого состояния хранили в VectaShield (Vector Laboratories LTD., Питерборо, Великобритания) в чашках Петри со стеклянным дном при 4 °C и сканировали с помощью конфокальной микроскопии в течение 2–4 недель.

Данные пространственного изображения были получены с использованием конфокального микроскопа Leica SP5 со спектральным детектированием (Leica Microsystems, Inc.) и водно-иммерсионного объектива HCX IRAPO L 25x/0,95 NA . Z-стеки были получены с использованием резонансного сканера (8000 Гц, 8-кратное усреднение строк, 1024 × 1024 пикселей).Флуоресценция Alexa 488 возбуждалась при 488 нм, а эмиссия регистрировалась при 500–550 нм. Шум изображения был уменьшен за счет деконволюции изображения (Huygens Pro, SVI B.V.; оптимизированный подход к оценке максимального правдоподобия; пять итераций). Обработанные z-стеки проецировались методом проекции максимальной интенсивности. Анализ изображений проекций выполняли с использованием программного обеспечения ImageJ, [http://rsbweb.nih.gov/ij/]. Центральная область мозга из 11–12 на каждое состояние была выбрана вручную с помощью инструмента «от руки» и было измерено среднее значение серого, связанное с выбранной областью каждого мозга.

Условия культивирования клеток и клеточные линии

Среды для культивирования и добавки для культивирования клеток были приобретены у Gibco-Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США), а пластиковая посуда — у Corning (Корнинг, Нью-Йорк, США). Клетки остеосаркомы человека U2OS (линия клеток была приобретена у ATCC [HTB-96]) и их производные, экспрессирующие GFP-LC3, культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 мг/л пирувата натрия, 10 мМ HEPES-буфера, 100 мкл. ед/мл пенициллина G натрия и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина (37 °C, 5% CO 2 ).Клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 (клеточная линия была приобретена у ATCC [HB8065]) культивировали в среде EMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 мг/л пирувата натрия, 10 мМ буфера HEPES, 100 ед/мл пенициллина G натрия и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина. Клетки колоректального рака человека HCT116 (линия клеток была приобретена в ATCC [CCL-247]) культивировали в среде McCoy, обогащенной 10% эмбриональной бычьей сывороткой, 100 мг/л пирувата натрия, 10 мМ буфера HEPES, 100 ед./мл пенициллина G натрия. и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина.Для индукции аутофагии клетки обрабатывали в течение 8 ч 50 мкМ DMC (Sigma Aldrich [S617237]) в присутствии или в отсутствие 50 мкМ хлорохина (Sigma Aldrich [C6628]), чтобы правильно оценить поток аутофагии.

Измерения аутофагии клеточной культуры с помощью автоматизированной микроскопии

Клетки GFP-LC3 U2OS были получены путем трансфекции клеток U2OS плазмидой pEGFP-LC3 и поддерживались посредством селекции с помощью неомицина. Клетки GFP-LC3 HCT116 получали путем трансфекции лентивирусной конструкцией GFP-LC3 (Millipore [17-10193]).Клетки U2OS или HCT116, стабильно экспрессирующие GFP-LC3, высевали в 96-луночные или 384-луночные планшеты для визуализации (Greiner) за 24 часа до стимуляции. Клетки обрабатывали DMC в течение 8 ч в присутствии или в отсутствие хлорохина (в течение 2 ч до фиксации). Затем клетки фиксировали 4% PFA и контрастно окрашивали 10 мкМ Hoechst 33342. Изображения получали с использованием автоматизированного микроскопа BD path 855 (BD Imageing Systems, Сан-Хосе, США), оснащенного объективом 40X (Olympus, Center Valley, США). в сочетании с роботизированным манипулятором планшетов Twister II (Caliper Life Sciences, Хопкинтон, США).Изображения анализировали на наличие точек GFP-LC3 в цитоплазме с помощью программного обеспечения BD Attovision (BD Imageing Systems). Клеточные поверхности были сегментированы и разделены на цитоплазматические и ядерные области в соответствии со стандартными процедурами производителя. Алгоритмы RB 2×2 и Marr-Hildreth использовались для распознавания цитоплазматических GFP-LC3 положительных точек. Для анализа миРНК клетки U2OS, стабильно экспрессирующие GFP-LC3, трансфицировали скремблированной миРНК (siCtr) или миРНК, нацеленными на GATA1 (siGATA1), GATA2 (siGATA2), GATA3 (siGATA3), GATA4 (siGATA4), GATA5 (siGATA5), GATA6 (siGATA6). ), TRPS1 (siTRPS1) и Atg5 (siAtg5) (3 отдельные последовательности миРНК на каждый ген, см. Таблицу 5) в течение 48 часов, после чего вводят 50 мкМ DMC (или 10 мкМ рапамицина) или выдерживают в контрольных условиях в течение дополнительных 6 часов.После этого клетки фиксировали и измеряли аутофагию, как описано выше. Для количественной оценки рассчитывали среднее значение и SEM из данных всех трех отдельных последовательностей siRNA. Эффективность нокдауна была подтверждена вестерн-блоттингом (дополнительная фигура 13).

Анализ хронологического старения дрожжей

Анализ проводили, как описано у Leontieva et al. 70 . Вкратце, 80 000 клеток высевали в 96-луночные планшеты и не обрабатывали или обрабатывали 50 мкМ DMC.Через 5 дней мертвые клетки и кондиционирующую среду удаляли, клетки обрабатывали трипсином и 10% аликвоту высевали в заполненные свежей средой шестилуночные планшеты. Через 1 неделю клоны помечали окрашиванием кристаллическим фиолетовым и подсчитывали.

Определение фосфорилирования S6K1

Клетки U20S обрабатывали в течение 6 ч двумя различными дозами DMC или рапамицина (1 мкМ). Активность mTORC1 оценивали с помощью иммуноблоттинга и оценивали как уровни фосфорилирования его целевой рибосомальной протеинкиназы S6 бета-1 (S6K1/P70S6K1) на треонине 389 с использованием фосфоспецифического антитела (Cell Signaling Technology, [#9205]).Рапамицин использовали в качестве положительного контроля ингибирования mTORC1.

Проверка и извлечение растений

Angelica keiskei koidzumi растений были приобретены у местного продавца. Растения проявляли морфологические признаки вида, включая перистые листья, пильчатые, 3-раздельные листочки, длинные черешки с чехлами и характерную окраску сока. Кроме того, ДНК растений, выделенная из быстрозамороженных листьев, была проверена на генотип. Следовательно, ядерная рДНК (внутренний транскрибируемый спейсер 1, 5.Ген рибосомной РНК 8S и внутренний транскрибируемый спейсер 2) амплифицировали с праймерами ITS4 и ITS5 (дополнительная таблица 5), а продукт секвенировали с использованием тех же праймеров (MWG Biotech, Эберсберг, Германия). Сравнение с инвентарным номером GenBank. GU395158.1 подтвердил генотип Angelica keiskei koidzumi .

Для обнаружения DMC в Angelica keiskei koidzumi собирали свежий растительный материал (~2  г корней и черешков/листьев, соответственно), разрезали на кусочки размером 5 × 5 мм, быстро замораживали и измельчали ​​с предварительно охлажденной сталью бисер в бисерной мельнице (мини-бисер, Biospec Products).Растительный порошок подвергали сухой заморозке и выдерживали при температуре -80°C не менее 24 ч перед экстракцией (процедуру экстракции см. в разделе «Экстракции и измерения DMC»).

Содержание мышей и приготовление сыворотки

Самцы мышей C57BL/6 были приобретены у Janvier Labs, Франция. Лечение животных начинали в возрасте 12 месяцев. Всех мышей содержали и лечили в соответствии с национальными и европейскими этическими нормами (Директива 2010/63/ЕС) и экспериментами, одобренными ответственным государственным органом (Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft, BMWFW, Австрия).Мышей кормили вволю обычным кормом (гранулы, Ssniff, Германия) с добавлением 0,25% ДМК в течение 7 дней. Физическая активность животных, исследования, дефекация, потребление пищи и воды, а также масса тела тщательно контролировались для обеспечения нормального поведения. В конце эксперимента животных анестезировали ингаляцией изофлурана и умерщвляли. Плазму получали центрифугированием при 200 ×  g в течение 10 мин при 4 °C и выдерживали при -80°C до выделения.

Для измерения аутофагии мышей использовали 6-недельных самцов мышей дикого типа C57BL/6 или Atg4b -/- (Harlan, Франция).Эксперименты на животных проводились в соответствии с Директивой ЕС 63/2010, а протокол APAFIS № 10511-2017070511526660 v2 был одобрен Этическим комитетом CRC (CEEA № 5, зарегистрирован в Министерстве исследований Франции). Atg4b -/- мышей были любезно предоставлены д-ром Carlos Lopez-Otin (Университет Овьедо, Испания).

Мышей содержали в среде с контролируемой температурой с 12-часовыми циклами свет/темнота и получали пищу и воду без ограничений. Мышам внутрибрюшинно вводили однократную дозу 100 мг/кг ДМК, растворенного в 50 мкл ДМСО, и 30 мг/кг лейпептина (за 2 часа до умерщвления) и через 6 часов умерщвляли.Ткани быстро замораживали в жидком азоте и гомогенизировали (два цикла по 20 секунд при 5500 об/мин [скорость двигателя]) с использованием гомогенатора тканей Precellys 24 (Bertin Technologies, Монтиньи-ле-Бретонне, Франция) в 20-мМ трис-буфере (pH 7,4). ), содержащий 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 10 мМ ЭДТА и смесь ингибиторов протеазы Complete® (Roche Applied Science, Пенцберг, Германия). Затем экстракты тканей центрифугировали при 12 000 ×  g при 4 °C и собирали супернатанты. Концентрацию белка в супернатантах оценивали с помощью метода с бицинхониновой кислотой (набор для анализа белка ВСА, Pierce Biotechnology, Рокфорд, США).

Для лечения длительной ишемии in vivo из лаборатории Джексона были получены 3-месячные самцы мышей C57BL/6J дикого типа или мышей с нокаутом по Atg7, специфичным для сердца (Atg7cKO). Всех мышей содержали и лечили в соответствии с национальными этическими нормами (протокол IACUC № 17022), а эксперименты были одобрены ответственным учреждением (Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Медицинской школы Рутгерса-Нью-Джерси). Мышей помещали в среду с контролируемой температурой с 12-часовыми циклами свет/темнота, где они получали пищу и воду вволю.Трехмесячных мышей C57BL/6 J анестезировали внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (60 мг/кг). Использовался аппарат ИВЛ для грызунов (Minivent; Harvard Apparatus Inc.) с 65% кислорода. Животных согревали с помощью тепловых ламп. Ректальную температуру контролировали и поддерживали в пределах 36,8–37,2 °С. Грудную клетку вскрыли горизонтальным разрезом в четвертом межреберье. Ишемия была достигнута путем лигирования передней нисходящей ветви левой коронарной артерии (ПНА) проленовым швом 8-0 на 2 мм ниже границы между левым предсердием и ЛЖ.Ишемию подтверждали изменением ЭКГ (подъем сегмента ST) и изменением цвета миокарда. После выхода из наркоза мышей возвращали в клетки. Они были размещены в помещении с контролируемым климатом.

Определение метаболических изменений в сердце и печени мышей

Животных обрабатывали, как описано для измерения аутофагии у мышей (см. раздел «Мышеведение и приготовление сыворотки»). Все используемые стандартные и реактивные реактивы были получены от Sigma-Aldrich, за исключением карбоната аммония (VWR).Для подготовки образцов ткани печени и сердца около 30 мг тканей для каждого состояния сначала взвешивали и солюбилизировали в 1,5 мл полипропиленовых микроцентрифужных пробирках с керамическими шариками с 1 мл холодного лизатного буфера (МеОН/вода/хлороформ, 9/1/1). , -20 °С). Затем их трижды гомогенизировали в течение 20 с при 5500 об/мин (скорость двигателя) с использованием гомогенатора тканей Precellys 24 (Bertin Technologies, Монтиньи-ле-Бретонне, Франция) с последующим центрифугированием (10 мин при 15000 ×  г , 4 °). С).Затем верхнюю фазу надосадочной жидкости разделяли на две части: первые 270 мкл использовали для газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ/МС) при центрифугировании микропробирок, остальные 250 мкл использовали для жидкостной хроматографии сверхвысокого давления в сочетании с масс-спектрометрией. Эксперименты по спектрометрии (УВЭЖХ/МС).

Что касается аликвот ГХ-МС, 150 мкл переносили из микропробирки для центрифугирования в стеклянную пробирку и выпаривали. 50 мкл метоксиамина (20 мг/мл в пиридине) добавляли к высушенным экстрактам, затем выдерживали при комнатной температуре в темноте в течение 16 часов.На следующий день добавляли 80 мкл MSTFA, и окончательная дериватизация происходила при 40 °C в течение 30 минут. Затем образцы переносили во флаконы и вводили непосредственно в ГХ-МС.

Что касается аликвот ЖХ-МС, собранный супернатант выпаривали в микроцентрифужных пробирках при 40 °C в концентраторе с пневматическим приводом (Techne DB3, Стаффордшир, Великобритания ). Высушенные экстракты ЖХ-МС солюбилизировали 450 мкл воды MilliQ и разделяли на аликвоты в трех микроцентрифужных пробирках (100 мкл) для каждого метода ЖХ и в одной микроцентрифужной пробирке для безопасности.

Аликвоты для анализа переносили в пробирки для ЖХ и вводили в ЖХ/МС или хранили при -80 °C до инъекции.

Для подготовки образцов полиаминов (печень, сердце) около 30 мг тканей для каждого состояния сначала взвешивали и солюбилизировали в полипропиленовых микроцентрифужных пробирках на 1,5 мл с 1 мл холодного лизатного буфера с 1% сульфосалициловой кислотой (MeOH/вода 1 % SSA, 9/1, −20 °C). Затем их трижды гомогенизировали в течение 20 с при 5500 об/мин (скорость двигателя) с использованием гомогенатора тканей Precellys 24 (Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, Франция) с последующим центрифугированием (10 мин при 15 000 g, 4°C).Шестьсот микролитров верхней фазы супернатанта собирали и выпаривали в микроцентрифужных пробирках при 40 °C в концентраторе с пневматическим приводом (Techne DB3, Стаффордшир, Великобритания). Высушенные экстракты ЖХ-МС растворяли в 300 мкл воды MilliQ, центрифугировали (10 мин при 15 000 х г, , 4 °С), 50 мкл переносили в полипропиленовый флакон для инъекций для метода ЖХ, а остальное переносили в микроцентрифугу. трубка для безопасности. Аликвоты, перенесенные в полипропиленовые флаконы, вводили в ЖХ/МС или хранили при -80 °C до введения.

Был проведен ряд целевых и нецелевых анализов, чтобы получить полную картину метаболического воздействия DMC. Обратите внимание, что все переходы MRM для указанных ниже методов доступны по запросу.

(1) Целевой анализ КоАз и нуклеозидфосфатов с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (СВЭЖХ) с ионным паром в сочетании с масс-спектрометром тройного квадруполя (QQQ) выполняли на системе RRLC 1260 (Agilent Technologies, Вальдбронн, Германия) в сочетании с до Triple Quadrupole 6410 (Agilent Technologies), оснащенного источником электрораспыления, работающим в положительном режиме.Температуру газа устанавливали на 350 °С при расходе газа 12 л/мин. Капиллярное напряжение было установлено на уровне 3,5 кВ. 10 мкл образца вводили в колонку XDB-C18 (размер частиц 100 мм × 2,1 мм, размер частиц 1,8 мкм) от Agilent Technologies, защищенную защитной колонкой XDB-C18 (размер частиц 5 мм × 2,1 мм, размер частиц 1,8 мкм) и нагревали при 40°С. °C в печи-грануляторе. Нагрев колонки выше комнатной температуры позволил строго контролировать температуру колонки. Градиентная подвижная фаза состояла из воды с 2 мМ DBAA (A) и ацетонитрила (B).Скорость потока была установлена ​​на 0,2 мл/мин, а градиент был следующим: исходное состояние составляло 90% фазы А и 10% фазы В, поддерживаемое в течение 4 минут. Затем молекулы элюировали с использованием градиента от 10% до 95% фазы B в течение 3 мин. Колонку промывали с использованием 95% подвижной фазы В в течение 3 мин и уравновешивали с использованием 10% подвижной фазы В в течение 3 мин. Автосамплер хранили при 4 °C. В конце серии анализа колонку промывали водой MilliQ со скоростью 0,3 мл/мин (фаза A) и ацетонитрилом (фаза B) следующим образом: 10 % фазы B в течение 20 минут до 90 % фазы B в течение 20 минут, и поддерживается в течение 20 мин до выключения.Газом столкновения был азот. Используемый режим сканирования представлял собой MRM для биологических образцов. Обнаружение пиков и интегрирование 23 аналитов выполняли с использованием количественного программного обеспечения Agilent Mass Hunter (B.07.01).

(2) Широконаправленный анализ внутриклеточных метаболитов газовой хроматографией (ГХ) в сочетании с масс-спектрометром с тройным квадруполем (QQQ) проводили на газовой хроматографии 7890 A (Agilent Technologies, Waldbronn, Германия) в сочетании с тройным квадруполем 7000 C (Agilent Technologies, Вальдброн, Германия), оснащенный высокочувствительным источником электронного удара (ЭИ), работающим в положительном режиме.Температура фронта на входе составляла 250 °С, впрыск производился в безразделительном режиме. Температура линии передачи и источника ионов составляла 250 °С и 230 °С соответственно. Поток продувки септы был зафиксирован на уровне 3 мл/мин, поток продувки для раздельного вентиля работал на уровне 80 мл/мин в течение 1 мин, а режим экономии газа был установлен на 15 мл/мин через 5 мин. Газообразный гелий проходил через колонку (J&WScientificHP-5MS, 30 м ×0,25 мм, внутренний диаметр 0,25 мм, df, Agilent Technologies Inc.) со скоростью 1мл/мин. Температуру колонки поддерживали на уровне 60°С в течение 1 мин, затем повышали до 210°С (10°С/мин), затем повышали до 230°С (5°С/мин) и достигали 325°С (15°С/мин). /мин) и выдержать при этой температуре 5 мин.Газом столкновения был азот. Используемый режим сканирования представлял собой MRM для биологических образцов. Обнаружение пиков и интегрирование 133 аналитов выполняли с использованием количественного программного обеспечения Agilent Mass Hunter (B.07.01).

(3) Целевой анализ полиаминов с помощью УВЭЖХ с ионными парами в сочетании с масс-спектрометром Triple Quadrupole (QQQ) проводили на системе RRLC 1260 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), соединенной с Triple Quadrupole 6410 (Agilent Technologies), оснащенной источник электрораспыления, работающий в положительном режиме.Температуру газа устанавливали на 350 °С при расходе газа 12 л/мин. Капиллярное напряжение было установлено на уровне 3,5 кВ. 10 мкл образца вводили в колонку Kinetex C18 (150 мм × 2,1 мм, размер частиц 2,6 мкм) от Phenomenex, защищенную защитной колонкой C18 (5 мм × 2,1 мм) и нагревая при 40 °C в печи для гранулирования. Градиентная подвижная фаза состояла из свежеприготовленной воды с 0,1% ГФБК (А) и ацетонитрила с 0,1% ГФБК (Б). Скорость потока была установлена ​​на 0,2 мл/мин, а градиент был следующим: исходное состояние составляло 95% фазы А и 5% фазы В.Затем молекулы элюировали с использованием градиента от 5% до 40% фазы B в течение 10 мин. Колонку промывали с использованием 90% подвижной фазы В в течение 2,5 мин и уравновешивали с использованием 5% подвижной фазы В в течение 4 мин. Автосамплер хранили при 4 °C. В конце серии анализа колонку промывали водой MilliQ со скоростью 0,3 мл/мин (фаза A) и ацетонитрилом (фаза B) следующим образом: 10 % фазы B в течение 20 минут до 90 % фазы B в течение 20 минут, и поддерживается в течение 20 мин до выключения. Газом столкновения был азот. Используемый режим сканирования представлял собой MRM для биологических образцов.Обнаружение пиков и интегрирование 14 аналитов выполняли с использованием количественного программного обеспечения Agilent Mass Hunter (B.07.01).

(4) Целевой анализ желчных кислот с помощью УВЭЖХ с ионным паром в сочетании с масс-спектрометром Triple Quadrupole (QQQ) проводили на системе RRLC 1260 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), соединенной с Triple Quadrupole 6410 (Agilent Technologies), оснащенным с источником электрораспыления, работающим в положительном режиме. Температуру газа устанавливали на 325 °C при расходе газа 12 л/мин.Капиллярное напряжение было установлено на уровне 4,5 кВ. 10 мкл образца вводили в колонку Poroshell 120 EC-C8 (100 мм × 2,1 мм, размер частиц 2,7 мкм) от Agilent Technologies, защищенную защитной колонкой XDB-C18 (5 мм × 2,1 мм, размер частиц 1,8 мкм) и нагревали. при 40 °C в печи для гранулирования. Градиентная подвижная фаза состояла из свежеприготовленной воды с 0,2% муравьиной кислоты (А) и смеси ацетонитрил/изопропанол (1/1; об./об.) (В). Скорость потока была установлена ​​на 0,3 мл/мин, а градиент был следующим: начальное состояние составляло 70% фазы А и 30% фазы В, поддерживаемое в течение 1.5 мин. Затем молекулы элюировали с использованием градиента от 30% до 60% фазы B в течение 9 мин. Колонку промывали с использованием 98% подвижной фазы В в течение 2 мин и уравновешивали с использованием 30% подвижной фазы В в течение 2 мин. После каждой инъекции иглу дважды промывали изопропанолом и трижды водой. Автосамплер хранили при 4 °C. В конце серии анализа колонку промывали водой MilliQ со скоростью 0,3 мл/мин (фаза A) и ацетонитрилом (фаза B) следующим образом: 10 % фазы B в течение 20 минут до 90 % фазы B в течение 20 минут, и поддерживается в течение 20 мин до выключения.Газом столкновения был азот. Используемый режим сканирования представлял собой MRM для биологических образцов. Обнаружение пиков и интегрирование 28 аналитов выполняли с использованием количественного программного обеспечения Agilent Mass Hunter (B.07.01).

(5) Нецелевой анализ внутриклеточных метаболитов с помощью УВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометром Q-Exactive с использованием обращенно-фазового ацетонитрильного метода проводили на системе УВЭЖХ Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientific), соединенной с Q-Exactive (Thermo Scientific). ), оснащенный источником электрораспыления, работающим как в положительном, так и в отрицательном режиме и в режиме полного сканирования от 100 до 1200  м/з .Параметры Q-Exactive: скорость потока газа оболочки 50 а.е., скорость потока вспомогательного газа 10 а.е., напряжение распыления 4 кВ, температура капилляра 300 °C, уровень RF S-Lens 55 В. 10 мкл образца вводили на SB- Колонка Aq (100 мм х 2,1 мм, размер частиц 1,8 мкм) от Agilent Technologies, защищенная защитной колонкой XDB-C18 (5 мм х 2,1 мм, размер частиц 1,8 мкм) и нагретая при 40°С в печи для гранулирования. Градиентная подвижная фаза состояла из воды с 0,2% уксусной кислоты (А) и ацетонитрила (Б). Скорость потока была установлена ​​на 0.5 мл/мин. Исходным состоянием было 98% фазы А и 2% фазы В. Затем молекулы элюировали с использованием градиента от 2% до 95% фазы В в течение 8 мин. Колонку промывали с использованием 95% подвижной фазы В в течение 3 мин и уравновешивали с использованием 2% подвижной фазы В в течение 3 мин. Автосамплер хранили при 4 °C. В конце партии анализа колонку промывали водой MilliQ со скоростью 0,4 мл/мин (фаза A) и ацетонитрилом (фаза B) следующим образом: 10 % фазы B в течение 20 минут до 90 % фазы B в течение 20 минут, и поддерживается в течение 20 мин до выключения.Обнаружение и интегрирование пиков выполняли с использованием количественного программного обеспечения Thermo Xcalibur (3.1.).

(6) Нецелевой анализ внутриклеточных метаболитов с помощью УВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометром Q-Exactive с использованием метанольного метода с обращенной фазой проводили на системе УВЭЖХ Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientific), соединенной с Q-Exactive (Thermo Scientific). оснащен источником электрораспыления, работающим как в положительном, так и в отрицательном режиме и в режиме полного сканирования от 66 до 990  м/з .Параметры Q-Exactive были следующие: скорость потока защитного газа 50 а.е., скорость потока вспомогательного газа 10 а.е., напряжение распыления 4 кВ, температура капилляра 300 °C, уровень RF S-Lens 55 В. Десять микролитров образца вводили на Eclipse Plus. колонка (100 мм × 2,1 мм, размер частиц 1,8 мкм) от Agilent Technologies, защищенная защитной колонкой XDB-C18 (5 мм × 2,1 мм, размер частиц 1,8 мкм) и нагретая при 40 °C в печи для гранулирования. Градиентная подвижная фаза состояла из воды с 0,05% муравьиной кислоты (А) и метанола с 0.05% муравьиной кислоты (В). Скорость потока была установлена ​​на 0,35 мл/мин. Исходное состояние: 95 % фазы А и 5 % фазы В в течение 4 мин. Затем молекулы элюировали с использованием градиента от 5% до 60% фазы B в течение 13 мин. Затем колонку промывали с использованием 90% подвижной фазы В в течение 2,5 мин и уравновешивали с использованием 5% подвижной фазы В в течение 7,5 мин. Автосамплер хранили при 4 °C. В конце партии анализа колонку промывали водой MilliQ со скоростью 0,4 мл/мин (фаза A) и ацетонитрилом (фаза B) следующим образом: 10 % фазы B в течение 20 минут до 90 % фазы B в течение 20 минут, и поддерживается в течение 20 мин до выключения.Обнаружение и интегрирование пиков выполняли с использованием количественного программного обеспечения Thermo Xcalibur (3.1.).

(7) Нецелевой анализ внутриклеточных метаболитов с помощью УВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометром Q-Exactive с использованием метода HILIC проводили на системе УВЭЖХ Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientific), соединенной с Q-Exactive (Thermo Scientific), оснащенной источник электрораспыления, работающий как в положительном, так и в отрицательном режиме и в режиме полного сканирования от 66 до 990  м/з. Параметры Q-Exactive: скорость потока газа оболочки 50 а.е., скорость потока вспомогательного газа 10 а.е., напряжение распыления 4 кВ, температура капилляра 300 °C, уровень RF S-Lens 55 В.Образец разбавляли конечным объемом 50% ацетонитрила, затем 5 мкл инъецировали на SeQuant ZIC-pHILIC (размер частиц 150 мм × 2,1 мм и 5 мкм) от Merck Millipore, защищенный защитной колонкой SeQuant ZIC-pHILIC (20 мм × 2,1 мм, размер частиц 5 мкм) и нагревали при 40 °C в печи для гранулирования. Градиентная подвижная фаза состояла из воды с 20 мМ карбоната аммония (А) и ацетонитрила (В). Скорость потока была установлена ​​на уровне 0,3 мл/мин. Начальное состояние: 5% фазы А и 95% фазы В в течение 1 мин. Затем молекулы элюировали с использованием следующего градиента: 92% за 2 мин, 86.5% за 0,5 мин, 65% за 17,5 мин подвижной фазы В. Колонку промывали с использованием 10% подвижной фазы В в течение 4,5 мин, а затем уравновешивали для следующего анализа с использованием 95% подвижной фазы В в течение 9 мин. Автосамплер хранили при 4 °C. По окончании серии анализов колонку промывали 0,3 мл/мин воды, 5 мМ ацетата аммония (фаза А) и ацетонитрила (фаза В) следующим образом: 50 % фазы В в течение 21 мин, до 80 % фазы В в течение 21 мин. 21 мин и поддерживается в течение 18 мин до выключения. Для удаления остаточных солей из трубок добавляли дополнительную промывку автодозатора (вода/ацетонитрил; 9/1; об./об.) в течение 15 мин при отключенной колонке.Обнаружение и интегрирование пиков выполняли с использованием количественного программного обеспечения Thermo Xcalibur (3.1.). Полный набор данных доступен в дополнительных файлах данных 3 и 4.

Кластеризация метаболитов

Иерархическая кластеризация была выполнена с использованием пакета MetaboAnalyst 3.0 71 с использованием данных, нормализованных по логарифму 2, в качестве входных данных с использованием следующих параметров (если не указано иное): отсутствует оценка стоимости: пропущена; нормализация данных: нет; преобразование данных: нет; масштабирование данных: нет; мера расстояния: Пирсон; алгоритм кластеризации: Ward; цветовой контраст по умолчанию; топ-50 метаболитов ранжированы по t -тестам; стандартизация данных: функции автомасштабирования.Комбинированный анализ топологии путей и обогащения был выполнен с использованием инструмента анализа путей MetaboAnalyst 3.0 со следующими параметрами: оценка отсутствующего значения: пропущено; нормализация данных: нет; преобразование данных: нет; масштабирование данных: нет; анализ обогащения пути: глобальный тест; анализ топологии пути: относительное центральное положение; ссылка: все соединения выбранных путей. Пути с воздействием «0» были исключены. Поскольку гексозофосфат не может быть четко отнесен к конкретному метаболиту, он был исключен из анализа топологии пути дрожжей.Полный анализ топологии пути доступен в дополнительном файле данных 1 (дрожжи), дополнительном файле данных 3 (мышиное сердце) и дополнительном файле данных 4 (мышиная печень).

Измерение размера инфаркта

Через три часа после перевязки ПМЖВ животных анестезировали, интубировали и вскрывали грудную клетку. Для разграничения зоны риска ишемии (AAR) краситель Alcian blue (1%) перфузировали в аорту и коронарные артерии. Вырезали сердца и нарезали ЛЖ на поперечные срезы толщиной 1 мм.Затем срезы сердца инкубировали с 1% раствором хлорида трифенилтетразолия при 37°С в течение 15 мин. Площадь инфаркта (белая), AAR (не синяя) и общая площадь ЛЖ с обеих сторон каждой секции измерялись с использованием программного обеспечения ImageJ, и полученные значения усреднялись. Процент площади инфаркта и AAR каждой секции умножали на массу секции, а затем суммировали по всем секциям. AAR/LV и площадь инфаркта/AAR выражали в процентах.

Интоксикация этанолом и определение активности АЛТ

Мышей не кормили в течение 6 часов, а затем им вводили 33% (об./об.) раствор этанола в общей кумулятивной дозе 4.5 г/кг четырьмя поровну через желудочный зонд с 20-минутными интервалами, как описано в Ding et al. 72 . Мыши контрольной группы получали тот же объем воды. Наполнитель (ДМСО) или ДМК вводили мышам внутрибрюшинно за 30 мин до введения этанола. Сбор крови под нижней челюстью произошел через 16 часов после приема этанола. Повреждение печени количественно оценивали по активности АЛТ в сыворотке (активность аланинаминотрансферазы) с помощью специального набора (набор для анализа активности аланинтрансаминазы, Abcam [ab105134]). Активность АЛТ рассчитывали как [мЕ*мг -1 ] пирувата, образующегося в реакции.

Экстракции и измерения DMC

Для экстракции DMC образцов растений 10 мг растительного порошка помещали в 1 мл этилацетата, и образцы экстрагировали при комнатной температуре в течение часа в ультразвуковой ванне, а затем еще час на шейкере при 145 об/мин (скорость двигателя). После этого образцы центрифугировали, супернатант выпаривали с использованием потока азота при комнатной температуре, а полученный остаток восстанавливали в 100 мкл 60% ацетонитрила. Для экстракции DMC плазмы мышей 40 мкл плазмы осаждали 150 мкл ацетонитрила, встряхивали и центрифугировали.Супернатант упаривали при комнатной температуре в токе азота. Остаток растворяли в 50 мкл 60% ацетонитрила.

Все полученные образцы были проанализированы с помощью ЖХ/МС. Эксперименты проводились на системе Ultimate 3000 (Dionex, LCPackings, Вена, Австрия), соединенной с LTQ Orbitrap (ThermoFinnigan, Вена, Австрия), с использованием источника ионов ESI в положительном режиме. Система управлялась Xcalibur Software 1.4. Хроматографию проводили на колонке Gemini C18, 20×5 мм, 3 мкм (Phenomenex, Torrance, USA) с использованием 0.1% муравьиной кислоты в воде (А) и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (В) в качестве подвижной фазы. Разделение проводили в условиях градиентного элюирования: от 60% B до 90% B за 8,5 мин, поддерживая постоянный уровень 90% B в течение 3 мин и повторно уравновешивая в течение 4 мин. Скорость потока составляла 200 мкл/мин при 30  °С, объем ввода 20 мкл. Для масс-спектрометрических измерений одновременно отслеживали 2 события сканирования: режим сканирования в FTMS и сканирование производственных ионов 269 (CID 35) в ионной ловушке LTQ.

Иммуноблоттинг

Приготовление экстрактов дрожжевых клеток для анализа аутофагии EGFP-Atg8 и уровни экспрессии белков Atg, меченных HA, выполняли, как описано 17 .Таким образом, три ОП 600 единиц клеток (~1 × 10 8 клеток) собирали центрифугированием при 10 000 ×  г в течение 1 мин, однократно промывали 500 мкл H 2 O и ресуспендировали в буфер (1,85 M NaOH, 7,5% 2-меркаптоэтанол) и инкубировали в течение 10 мин на льду. Затем добавляли 300 мкл 55% трихлоруксусной кислоты, пробы кратковременно перемешивали и инкубировали еще 10 мин на льду. Осадок осаждали центрифугированием при 10 000 ×  г при 4 °C в течение 10 минут и удаляли надосадочную жидкость (с последующим коротким вращением для удаления остаточного надосадочной жидкости).Осадок ресуспендировали в 150 мкл буфера для образцов (200 мМ Трис/HCl, pH 6,8, 2 % ДСН, 10 % глицерина, 120 мМ ДТТ, 0,004 % бромфенолового синего), помещали в ультразвуковую баню на 5 мин, а затем кипятили в течение 5 мин. при 95 °С. Перед гель-электрофорезом образцы центрифугировали при 10 000 ×  g в течение 1 мин.

Иммуноблотинг проводили по стандартным протоколам. Блоты исследовали с помощью мышиных моноклональных антител против GFP (Roche, [#1814460], 1:5000 в TBS + 1% сухого молока) или HA (Sigma-Aldrich, [H-9658], 1:10000 в TBS + 1% сухого молока). молоко) и соответствующее аффинно очищенное вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой (Sigma, [#F-9137], 1:10 000 в TBS + 1% сухого молока).

Для экспериментов с клеточными культурами человека белки экстрагировали из клеток с помощью буфера для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA). Двадцать пять микрограммов белков разделяли на 4–12% бис-трис акриламиде (Thermo Fisher Scientific Inc.) и электропереносили на мембрану Immun-Blot® PVDF (Biorad). Затем мембраны разрезали горизонтально на разные части в соответствии с молекулярной массой интересующий белок, чтобы обеспечить одновременное обнаружение различных антигенов в рамках одного эксперимента.Сайты неспецифического связывания насыщали путем инкубации мембран в течение 1 ч в 0,05% Tween 20 (об.:об. в TBS) с добавлением 5% обезжиренного сухого молока (об.:об. в TBS) с последующей инкубацией в течение ночи с первичными антителами, специфичными для LC3B (Cell Signaling Technology, [#2775], кролик, 1:1000) и SQSTM1/p62 (Abnova, клон 2C11, [#H00008878-M01], мышь, 1:10000). Проявление проводили с соответствующими вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP) (Rabbit-HRP, Thermo Scientific, [#31460], 1:5000; Mouse-HRP, Thermo Scientific, [#31430], 1:5000) плюс Super Хемилюминесцентный субстрат Signal West Pico (Thermo Fisher Scientific Inc.). Антитело против глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы использовалось для контроля равной загрузки дорожек (для экспериментов с дрожжами: антитело было подарком от доктора Гюнтера Даума, кролик, 1:40 000; для экспериментов с клетками человека и мыши: Cell Signaling Technology , клон D16h21, [#5174], кролик, 1:10 000). Для тестов эффективности нокдауна миРНК GATA и контролей (дополнительная фигура 13) использовались следующие антитела: Thermo Fisher Scientific # PA1099X, кролик, 1: 500 (GATA1), Thermo Fisher Scientific [# 710242], кролик, 1: 100 ( GATA2), Cell Signaling Technology [#5852], кролик, 1:1000 (GATA3), Cell Signaling Technology [#36966], кролик, 1:1000 (GATA4), Thermo Fisher Scientific [#PA547262], коза, 1:200 (GATA5), Cell Signaling Technology [#5851], кролик, 1:1000 (GATA6), Abcam [#ab48820], кролик, 1:2000 (TRPS1), Cell Signaling Technology [#12994], кролик, 1:1000 ( Atg5).Полные сканы всех иммуноблотов представлены на дополнительном рисунке 17.

Статистические анализы

Количество независимых биологических повторов ( n ) указано в подписях к соответствующим графикам. Если не указано иное, независимость определяется для экспериментов с дрожжами как разные клоны или трансформанты, состаренные отдельно; для клеточной культуры в виде отдельно обработанных культур; для C. elegans , эксперименты с дрозофилами и мышами на разных животных.Размер образца был предварительно оценен на основе размера эффекта, наблюдаемого в первоначальных экспериментах с дрожжами. Ослепления в опытах не было. В тех случаях, когда удовлетворялись критерии нормальности (рассчитанные с помощью критериев Колмогорова-Смирнова и Бартлетта), значения P рассчитывались с использованием критерия Стьюдента t (двусторонний, непарный) или метода дисперсионного анализа (ANOVA) (для более чем две группы), а затем апостериорный тест Бонферрони. Непараметрические данные анализировали с помощью теста Краскела-Уоллиса с поправкой Данна на множественные сравнения.При необходимости данные были логарифмически преобразованы для достижения нормальности и однородных дисперсий и значимости, оцененных для преобразованных данных. Для данных с двумя переменными (например, обработка и штамм) был выполнен двухфакторный дисперсионный анализ с последующим тестированием простых основных эффектов (множественные сравнения различных уровней каждого фактора с поправкой Бонферрони в случае значительного основного фактора или взаимодействия). Значимость данных о выживаемости при старении дрожжей (факторы обработки и время) тестировали с использованием повторных измерений ANOVA (двухфакторный смешанный ANOVA) со временем в качестве внутрисубъектного фактора.Для анализа выживаемости были проведены тесты логарифмического ранга (Mantel-Cox) между состояниями, получавшими DMC, и без лечения, а порог значимости был адаптирован в соответствии с количеством парных сравнений. Если не указано иное, звездочки указывают значимость: *** P  < 0,001, ** P  < 0,01, * P  < 0,05. Статистику выполняли с помощью Origin Pro 2008 (OriginLab).

Сводка отчета

Дополнительную информацию о планах эксперимента можно найти в Сводке отчета об исследованиях в природе, связанной с этой статьей.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

АСК-зависимые инфламмасомы способствуют иммунопатологии и смертности при энцефалите простого герпеса

Abstract

Энцефалит, вызванный вирусом простого герпеса (HSE), является наиболее частой причиной спорадического вирусного энцефалита, и, несмотря на таргетную противовирусную терапию, результаты остаются неудовлетворительными. Хотя врожденная иммунная система имеет решающее значение для ограничения вируса простого герпеса типа I (ВПГ-1) в головном мозге, есть доказательства того, что длительное нейровоспаление способствует патогенезу ГСЭ.В этом исследовании мы исследовали вклад инфламмасом в патогенез заболевания на мышиной модели HSE. Инфламмасомы являются сигнальными платформами, которые активируют провоспалительные цитокины интерлейкин-1β (ИЛ-1β) и ИЛ-18. Мы обнаружили, что у мышей с дефицитом адапторного белка воспаления, связанного с апоптозом пятнистого белка, содержащего домен активации и рекрутирования каспазы (ASC), значительно улучшилась выживаемость и снизились уровни IL-1β и IL-18 в головном мозге. Важно отметить, что эта разница в выживаемости не зависела от репликации вируса в центральной нервной системе (ЦНС).Мы обнаружили, что микроглия, резидентные макрофаги ЦНС, являются первичными медиаторами АСК-зависимого воспалительного ответа во время инфекции. Используя in vitro глиальные инфекции и мышиную модель HSE, мы демонстрируем, что активация воспаления способствует экспрессии хемокинового (мотив CC) лиганда 6 (CCL6), хемоаттрактанта лейкоцитов. Более низкая концентрация CCL6 в головном мозге мышей ASC -/- коррелировала с меньшим количеством инфильтрирующих макрофагов во время инфекции.В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что инфламмасомы способствуют патогенному воспалению при СГЭ и обеспечивают механистическую связь между активацией глиальных инфламмасом и лейкоцитарной инфильтрацией. В нашем исследовании вклад инфламмасом в выживаемость не зависел от репликации вируса, что указывает на перспективную новую цель в борьбе с вредным воспалением при СГЭ.

Резюме автора

Хотя иммунная система имеет решающее значение для контроля инфекции вируса простого герпеса (ВПГ) в центральной нервной системе (ЦНС), длительный или чрезмерный иммунный ответ может быть вредным.Мы изучили вклад инфламмасом, врожденных иммунных белков, которые инициируют провоспалительную реакцию, в пагубное нейровоспаление в мышиной модели энцефалита простого герпеса (HSE). Мы обнаружили, что инфламмасомы, которые полагаются на адаптерный белок ASC, способствуют смертности и нейровоспалению независимо от контроля репликации вируса. Кроме того, мы демонстрируем, что воспалительный ответ на ВПГ в основном опосредуется микроглией и приводит к притоку макрофагов в ЦНС.Эти результаты дают представление о механизмах, которые вызывают патогенное воспаление при СГЭ, и предполагают многообещающую терапевтическую цель при лечении СГЭ.

Образец цитирования: Hayes CK, Wilcox DR, Yang Y, Coleman GK, Brown MA, Longnecker R (2021) ASC-зависимые инфламмасомы способствуют иммунопатологии и смертности при энцефалите простого герпеса. PLoS Pathog 17 (2): е1009285. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009285

Редактор: Нэнси Рааб-Трауб, Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл, США

Поступила в редакцию: 24 августа 2020 г.; Принято: 5 января 2021 г .; Опубликовано: 1 февраля 2021 г.

Авторское право: © 2021 Hayes et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные, за исключением данных массива ОТ-ПЦР, находятся в рукописи и ее файлах вспомогательной информации. Полные файлы массива ОТ-ПЦР доступны в базе данных Gene Expression Omnibus (GEO) (URL-адрес доступа https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE154176).

Финансирование: Эта работа, включая усилия RL, финансировалась HHS | НИЗ | Национальный институт неврологических расстройств и инсульта (NINDS) (R01NS110631). Эта работа, включая усилия CKH, финансировалась HHS | НИЗ | Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) (F30AI150049). Эта работа, включая усилия CKH, финансировалась HHS | Национальные институты здравоохранения (NIH) (T32GM008152). НИЗ: www.nih.gov.Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Вирус простого герпеса типа I (ВПГ-1) является нейротропным вирусом и наиболее частой причиной вирусного энцефалита [1]. Несмотря на противовирусную терапию, направленную на контроль репликации вируса, заболеваемость и смертность при энцефалите простого герпеса (ГСЭ) остаются высокими [2].Хотя врожденная иммунная система имеет решающее значение для контроля ранней репликации вируса [3,4], есть данные, свидетельствующие о том, что чрезмерное нейровоспаление может играть пагубную роль во время инфекции. В частности, длительная активация микроглии, резидентных макрофагов в центральной нервной системе (ЦНС) и рекрутирование инфильтрирующих лейкоцитов в головной мозг способствуют патологии при СГЭ [5,6]. Цитокины и другие маркеры воспаления повышены в спинномозговой жидкости пациентов даже через несколько месяцев после исчезновения симптомов [7].В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что иммунный ответ на ВПГ в головном мозге представляет собой точный баланс между контролем репликации вируса и иммунно-опосредованным повреждением [8], но специфические врожденные сигнальные пути, которые способствуют этому балансу, неизвестны.

Инфламмасомы представляют собой провоспалительные сигнальные платформы, которые реагируют на патогены и сигналы опасности клеток-хозяев. Активация воспаления инициируется вовлечением рецепторов распознавания образов (PRR) и приводит к последующей активации каспазы-1, что приводит к процессингу и высвобождению провоспалительных цитокинов интерлейкина-1β (IL-1β) и IL-18, и литическая форма гибели клеток, называемая пироптозом [9].Канонические инфламмасомы, в том числе NOD-, LRR- и пириновый домен, содержащий домен 3 (NLRP3) и отсутствующий в инфламмасомах меланомы 2 (AIM2), нуждаются в адапторном белке, связанном с апоптозом, пятнистом белке, содержащем домен активации и рекрутирования каспазы (ASC). [9]. Инфламмасомный сигнальный путь вовлечен в патогенез многих неврологических заболеваний, включая аутоиммунный энцефаломиелит, ишемический инсульт и нейродегенеративные заболевания [10-12].

Роль инфламмасом в патогенезе вирусных инфекций сложна: показано, что инфламмасомы защищают в одних моделях заболеваний и вредны в других [13–17].Недавняя работа продемонстрировала, что HSV-1 активирует несколько инфламмасом in vitro и in vivo, включая NLRP3 и AIM2 [18-22]. Однако эти исследования были в значительной степени ограничены моделями внутрибрюшинной и глазной инфекции. Внутрибрюшинная инокуляция высокими дозами HSV-1 приводила к более высоким титрам вируса в мозге мышей NLRP3 -/- , что свидетельствует о том, что инфламмасома NLRP3 может ограничивать нейроинвазивность [22]. В модели глазного герпесного стромального кератита мыши NLRP3 -/- продемонстрировали более сильный ранний иммунный ответ, что позволяет предположить, что NLRP3 играет иммуномодулирующую роль при инфекции роговицы [23].Роль, которую инфламмасомы играют в инфицировании ВПГ центральной нервной системы, и конкретные клеточные популяции, которые управляют этой реакцией, неизвестны.

В этом исследовании мы исследовали вклад инфламмасом в мышиную модель ГСЭ. Мы обнаружили улучшенную выживаемость у мышей ASC -/- по сравнению с мышами дикого типа (WT), но не обнаружили различий в выживаемости между мышами NLRP3 -/- и AIM2 -/- . Эти результаты соответствовали снижению провоспалительных цитокинов в головном мозге мышей ASC -/-.Интересно, что эта разница в иммунном ответе не зависела от репликации вируса. Мы идентифицировали микроглию как ключевой медиатор воспалительного ответа во время HSE и обнаружили, что активация глиального воспалительного процесса необходима для экспрессии моноцитарного хемоаттрактанта CCL6. Соответственно, у мышей ASC -/- было снижено количество инфильтрирующих макрофагов во время HSE.

Результаты

Адаптерный белок инфламмасомы ASC способствует смертности во время HSE

Роль инфламмасом в патогенезе вирусных инфекций зависит как от вируса, так и от ответа органа-хозяина, при этом инфламмасомы выполняют защитную роль в одних моделях заболеваний и вредную роль в других [14,17,24].Мыши с нокаутом IL-1β проявляют повышенную восприимчивость к инфекции в интраназальной модели HSE [25]. Поэтому мы предположили, что мыши с нокаутом инфламмасомы также будут более восприимчивы к заболеванию в модели энцефалита простого герпеса. Прямая интракраниальная инокуляция HSV-1 в мышиной модели HSE была использована для предотвращения любого искажающего влияния периферической репликации на нейроинвазивность. Мышей WT, NLRP3 -/-, AIM2 -/- и ASC -/- инфицировали и наблюдали за выживаемостью в течение 14 дней.Мыши WT начали заболевать на 4-й день после заражения со средним временем выживания 9,9 дней, и 52,9% дожили до конечной точки эксперимента (рис. 1А). Примечательно, что у мышей ASC -/- выживаемость значительно улучшилась по сравнению с WT, при этом 93,3% мышей ASC -/- дожили до экспериментальной конечной точки, а среднее время выживания составило 13,4 дня. Мыши NLRP3 -/- и AIM2 -/- не имели статистически значимых различий в выживаемости по сравнению с мышами дикого типа (71.4% и 36,4% соответственно). Это говорит о том, что, хотя отдельные компоненты сенсора инфламмасомы NLRP3 и AIM2 не нужны для выживания HSE, общий адаптер инфламмасомы ASC способствует смертности.

Рис. 1. ASC-зависимые инфламмасомы вносят вклад в патогенез ВПГ-1 энцефалита.

(A) Кривая выживаемости WT (n = 17), NLRP3 -/- (n = 14), AIM2 -/- (n = 11) и ASC -/- (n = 15) ) мышей, инфицированных внутричерепно 3×10 4 БОЕ HSV-1 KOS.Результаты объединяются из семи прививок. (B) Титры всего мозга инфицированных мышей WT, NLRP3 -/- и ASC -/- на 1, 3 и 4 дни после заражения (n = 7–12 на группу, 8 прививок). (C) Целый мозг IL-1β и (D) IL-18 от мышей WT, NLRP3 -/- и ASC -/- либо до заражения, либо на 1 и 3 день после заражения (n = 4- 5 на группу). Значения выражены как средние ± SEM (**P <0,01, ***P <0,001, ****P <0,0001).

https://дои.org/10.1371/journal.ppat.1009285.g001

Возможное объяснение улучшения выживаемости у мышей ASC -/- заключается в том, что ASC-зависимые инфламмасомы непосредственно влияют на репликацию HSV-1 в ЦНС. Чтобы проверить это, мы заразили мышей WT, NLRP3 -/- и ASC -/- и определили репликацию вируса в ткани головного мозга в различные моменты времени до среднего времени до гибели. Никакой разницы в вирусном титре не было обнаружено через 1, 3 или 4 дня после заражения, что указывает на то, что ни NLRP3, ни ASC не участвуют в контроле репликации HSV-1 в ЦНС (рис. 1B).Эти данные свидетельствуют о том, что различия в смертности между мышами WT и ASC -/- обусловлены иммуномодулирующей функцией ASC, а не влиянием на репликацию вируса.

После опосредованной инфламмасомами активации каспазы-1 про-ИЛ-1β и ИЛ-18 расщепляются до их активированных форм, которые служат в качестве нижестоящих медиаторов сигнального пути воспаления. Чтобы определить вклад ASC-зависимых инфламмасом в продукцию IL-1β и IL-18 при HSE, мы исследовали мышей в ранние сроки после заражения и до гибели (1-й и 3-й дни).Как и ожидалось, уровень IL-1β был низким в головном мозге неинфицированных мышей, но резко повышался у мышей дикого типа на 1-й и 3-й дни после заражения (рис. 1С). Мыши ASC -/- имели значительно более низкие уровни IL-1β, чем WT, в обе временные точки, что позволяет предположить, что ASC-зависимые инфламмасомы необходимы для продукции IL-1β во время HSE. Мыши NLRP3 -/- экспрессировали более высокие уровни IL-1β, чем WT, на 3-й день после заражения. Этот результат свидетельствует о том, что NLRP3 не способствует выработке IL-1β в головном мозге и может фактически играть иммуномодулирующую роль в регуляции продукции IL-1β, как ранее было показано при глазной инфекции HSV-1 [23].Концентрации IL-18 следовали аналогичной схеме, хотя у мышей ASC -/- уровни были значительно выше, чем у мышей дикого типа на неинфицированном исходном уровне (рис. 1D). На 1-й и 3-й дни после заражения у мышей дикого типа уровень IL-18 в головном мозге был значительно выше, чем у мышей NLRP3 -/- и ASC -/- , что свидетельствует о том, что ASC-зависимые инфламмасомы также необходимы для продукции IL-18. во время ВШЭ.

Микроглиальные ASC-зависимые инфламмасомы активируются во время HSE

Затем мы попытались определить, какие типы клеток в ЦНС опосредуют ASC-зависимый воспалительный ответ во время HSE.Микроглия является резидентным макрофагом ЦНС и, как известно, секретирует IL-1β в провоспалительных условиях [26]. Кроме того, микроглия была идентифицирована как ключевой фактор воспалительного ответа в модели черепно-мозговой травмы [27]. Таким образом, мы предположили, что микроглия и инфильтрирующие лейкоциты будут первичными типами клеток с активными воспалительными комплексами во время ГСЭ. Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали анализ флуоресцентно-меченого ингибитора активности каспазы (FLICA) в сочетании с традиционным проточным цитометрическим анализом для маркировки клеток активной каспазой-1.Реагент FAM-FLICA представляет собой проникающий через мембрану зонд, который необратимо связывается с активированной каспазой, избирательно метя клетки активированными инфламмасомами. На 3-й день после заражения одноклеточные суспензии диссоциированных клеток головного мозга метили реагентом FAM-FLICA и флуоресцентными антителами для идентификации резидентных CD45 mid CD11b + микроглии и CD45 lo ACSA-2 + астроцитов. , а также инфильтрирующие CD45 hi CD11b + лейкоциты.

Микроглия

демонстрировала сильную активацию воспалительных процессов во время инфекции, о чем свидетельствуют репрезентативные гистограммы проточной цитометрии, изображающие интенсивность FAM-FLICA от мышей WT и ASC -/- , либо ложно инфицированных, либо инфицированных HSV-1 (рис. 2A). Процент микроглии FAM-FLICA + значительно увеличился как у мышей WT, так и у мышей ASC -/- во время инфекции, хотя процент микроглии FAM-FLICA + был значительно ниже у инфицированных мышей ASC -/- . мышей по сравнению с WT (фиг. 2B).Поскольку интенсивность FAM-FLICA напрямую коррелирует с количеством активированной каспазы-1, мы также измерили среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) FAM-FLICA в каждой группе мышей и обнаружили аналогичное увеличение микроглии у инфицированных мышей WT. Следует отметить, что MFI не значительно увеличился в инфицированной микроглии ASC -/- по сравнению с ложно инфицированными клетками (рис. 2C). Активность каспазы-1 в микроглии ASC -/- не была полностью отменена, что позволяет предположить, что ASC-независимые неканонические воспалительные пути также активируются во время инфекции.Удивительно, но активность каспазы-1 в инфильтрирующих популяциях лейкоцитов CD11b + мышей WT и ASC -/- не увеличивалась во время инфекции (фиг. 2В). Астроциты также имели низкий уровень активности каспазы-1, которая не увеличивалась при инфицировании (рис. 2В). Эти данные показывают, что микроглия является ключевым фактором ASC-зависимой воспалительной активности во время HSE.

Рис. 2. Микроглиальные ASC-зависимые инфламмасомы активируются во время HSE.

Активность каспазы-1, специфичную для клеток, анализировали с помощью проточной цитометрии и анализа FLICA на 3-й день после инфицирования после внутричерепной инокуляции 3 x 10 6 БОЕ HSV-1 KOS.(A) Репрезентативные гистограммы проточной цитометрии CD45 mid CD11b+ микроглии от ложно инфицированных или инфицированных HSV-1 мышей WT и ASC -/- , окрашенных реагентом FLICA для количественного определения активной каспазы-1. Процент каждого типа клеток, которые являются FLICA+ (B) или FAM-FLICA, означает интенсивность флуоресценции (C) в астроцитах, микроглии и инфильтрирующих CD11b+ лейкоцитах (n = 3–4 мыши на группу). После исключения мультиплетов и мертвых клеток клетки гейтировали по следующей стратегии: астроциты CD45 lo /ACSA-2+, микроглия CD45 mid /CD11b+, инфильтрирующие лейкоциты CD45 hi /CD11b+.Значения выражены как средние ± SEM (**P <0,01, ***P <0,001, ****P <0,0001). Результаты являются репрезентативными для двух независимых экспериментов.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009285.g002

Продукция IL-1β зависит от микроглии в органотипической модели культуры срезов головного мозга энцефалита HSV

Мы продемонстрировали, что микроглия, выделенная из головного мозга, инфицированного ВПГ, имеет повышенную активность каспазы-1 (рис. 2). Чтобы подтвердить важность микроглии в активации воспаления и продукции IL-1β во время HSE, мы использовали модель органотипической культуры срезов головного мозга инфекции HSV-1.Наша группа и другие ранее использовали культуры срезов головного мозга (BSC) для моделирования энцефалита HSV-1, и они поддаются селективному истощению микроглии с использованием клодронатных липосом [3,28].

Срезы мозга были получены от мышей WT и оставлены для восстановления в культуре в течение 24 часов перед инкубацией со средой, содержащей либо клодронатсодержащие липосомы, либо эквивалентную концентрацию пустых липосом в качестве контроля (рис. 3A). После шести дней инкубации с клодронатом истощение микроглии было подтверждено проточной цитометрией (рис. 3В).Затем срезы либо инфицировали HSV-1, либо имитировали инфекцию с помощью контрольного носителя и инкубировали в течение 48 часов, момент времени, который ранее был определен как связанный с пиковым титром вируса в культурах срезов головного мозга [3]. Мы собрали культуральные среды и количественно определили IL-1β с помощью ELISA. В соответствии с нашими предыдущими результатами, уровни IL-1β резко возросли после инфицирования HSV-1 в BSC без истощения микроглии (рис. 3C). IL-1β не увеличивался во время инфекции в BSC с истощением микроглии и был значительно ниже на исходном уровне, чем в неистощенных BSC, демонстрируя, что активация воспалительного процесса и высвобождение IL-1β зависят от микроглии в модели HSE (рис. 3C).

Рис. 3. Продукция IL-1β зависит от микроглии в органотипической модели культивирования срезов головного мозга при ВПГ-энцефалите.

Микроглию удаляли из органотипических культур срезов головного мозга путем инкубации с липосомами, заполненными клодронатом, и после инфицирования ВПГ-1 определяли количество продукции IL-1β. (A) Схема экспериментальной установки. Срезы выдерживали в течение 24 часов в культуре перед инкубацией либо с заполненными клодронатом, либо с пустыми липосомами. Затем срезы инфицировали 10 6 БОЕ HSV-1 KOS и культуральную среду собирали через 48 часов после инфицирования.(B) Количественная оценка микроглии с помощью проточной цитометрии через 6 дней лечения клодронатом или пустыми липосомами (n = 4 среза на группу). (C) Уровни белка IL-1β, количественно определенные с помощью ELISA (n = 3 среза на группу). Значения выражены как средние ± SEM (* P <0,05, ** P <0,01).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009285.g003

Активация глиального воспалительного процесса стимулирует экспрессию моноцитарного хемокина CCL6 во время инфекции HSV-1

Наши результаты показали, что ASC-зависимые инфламмасомы увеличивают смертность при HSE и что микроглия вносит основной вклад в активность инфламмасом в головном мозге во время инфекции HSV.Чтобы лучше понять инфламмасомозависимые иммунные сигнальные механизмы в микроглии, которые способствуют иммунопатологии при СГЭ, мы провели скрининг ASC-зависимых провоспалительных цитокинов и хемокинов и подтвердили их экспрессию in vivo. Хотя микроглия была идентифицирована как ключевой медиатор воспаления in vivo (рис. 2 и 3), было показано, что врожденный иммунный ответ на ВПГ-1 включает перекрестные помехи между микроглией и астроцитами [29]. Поэтому мы использовали модель культуры смешанных глиальных клеток для скрининга цитокинов и хемокинов, которые индуцируются передачей сигналов астроцитарного или микроглиального воспаления.Микроглию и астроциты выделяли из мышей WT и ASC -/- и создавали совместные культуры с астроцитами ASC -/- , микроглией ASC -/- или обоими. После инфицирования ВПГ-1 in vitro экспрессию генов определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Два гена, Ccl6 и Il1rn , были значительно подавлены, по крайней мере, в одном из условий культивирования, содержащих клетки ASC -/- , по сравнению с культурами, содержащими только клетки WT (S1 Fig).Экспрессия гена Ccl6 в культурах астроцитов ASC -/- и микроглии ASC -/- была значительно ниже, чем в культурах астроцитов и микроглии WT (фиг. 4A). Таким образом, как астроцитарные, так и микроглиальные ASC вносят вклад в экспрессию CCL6 in vitro. Хемокин CCL6 является хемоаттрактантом моноцитов [30,31]. Ген Il1rn также подавлялся во всех трех условиях культивирования с ASC -/- астроцитами и/или микроглией (фиг. 4В). Il1rn кодирует антагонист рецептора IL-1, IL-1RA, который действует как негативный регулятор активности IL-1β [32].В качестве отрицательного регулятора экспрессия Il1rn , вероятно, тесно связана с инфламмасомной активностью, что объясняет его сниженную экспрессию в этих культурах.

Рис. 4. Активация глиального воспаления стимулирует экспрессию моноцитарного хемокина CCL6 во время инфекции HSV-1.

Совместные культуры глии инфицировали при MOI 5, а клеточную РНК выделяли через 12 часов после инфицирования. Относительная экспрессия генов (A) Ccl6 и (B) Il1rn в глиальных совместных культурах (n = 3–4 на группу).(C) Уровни белка CCL6 в головном мозге неинфицированных или инфицированных мышей на 1-й и 3-й дни после заражения (n = 4–5 на группу). Значения экспрессии генов выражены как средние значения ± стандартное отклонение, а значения уровней CCL6 выражены как средние значения ± стандартная ошибка среднего (* P <0,05, ** P <0,01).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009285.g004

Чтобы подтвердить роль ASC в экспрессии CCL6 in vivo, мы измерили концентрации CCL6 в мозге неинфицированных мышей WT и ASC -/- . или на 1-й и 3-й дни после заражения.Подобно концентрациям IL-18 (рис. 1D), CCL6 был немного выше у неинфицированных мышей ASC -/- по сравнению с мышами дикого типа (рис. 4C). CCL6 существенно не отличался между мышами WT и ASC -/- на 1-й день после заражения, но на 3-й день после заражения уровни CCL6 были ниже у мышей ASC -/- по сравнению с мышами WT (рис. 4C). Хотя ранняя экспрессия CCL6 не зависит от ASC, повышенная экспрессия этого хемокина зависит от ASC на более поздних стадиях инфекции.

ASC-зависимые инфламмасомы способствуют макрофагальной инфильтрации ЦНС во время HSE

Было показано, что инфильтрация лейкоцитов

в головной мозг важна для контроля репликации ВПГ-1, однако инфильтрация моноцитов CXCR3 + и Т-клеток была связана с пагубным воспалением при СГЭ [33,34].Мы продемонстрировали, что мыши ASC -/- имеют более низкие концентрации CCL6 на 3-й день после заражения. Основываясь на этом открытии, мы предположили, что у мышей ASC -/- снижена инфильтрация ЦНС лейкоцитами в этот момент времени. Мы исследовали несколько типов иммунных клеток, включая общую инфильтрирующую популяцию клеток CD45 hi , макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки (ДК) и CD4 + и CD8 + Т-клетки. Абсолютное количество общих клеток CD45 hi (рис. 5А), нейтрофилов, дендритных клеток и как CD4+, так и CD8+ было снижено у мышей ASC -/- (рис. 5В, 5С и 5D), хотя различия не достигли статистической значимости. .Примечательно, что абсолютное количество инфильтрирующих макрофагов было значительно снижено у ASC -/- по сравнению с мышами дикого типа, инфицированными HSV-1, что свидетельствует о том, что ASC-зависимые воспалительные процессы управляют инфильтрацией этого конкретного типа клеток (рис. 5E и 5F). В соответствии с нашими данными о выживании и экспрессии цитокинов, не было различий в инфильтрации макрофагов между мышами WT и NLRP3 -/- (рис. 5F).

Рис. 5. ASC-зависимые инфламмасомы способствуют миграции лейкоцитов в ЦНС во время HSV-1 энцефалита.

Инфильтрирующие лейкоциты в головном мозге анализировали с помощью проточной цитометрии у мышей WT, NLRP3 -/- и ASC -/- на 3-й день после заражения после внутричерепной инокуляции 3 x 10 6 БОЕ HSV-1 КОС. Всего CD45 hi клеток (А), дендритных клеток (В), нейтрофилов (С), CD4+ и CD8+ Т-клеток (D). Репрезентативные графики FACS экспрессии CD11c и CD11b в клетках CD45 hi и Ly6G-. Макрофаги закрыты как CD11b+ и CD11c- (E). Абсолютное количество макрофагов (F), рассчитанное по общему количеству клеток на 3-й день после заражения (n = 5, 3 повтора для миелоидных клеток; n = 3–4, 2 повтора для Т-клеток).После исключения мультиплетов типы клеток гейтировали в популяции CD45 hi с использованием следующей стратегии гейтирования: макрофаги/моноциты Ly6G-/CD11c-/CD11b+, дендритные клетки Ly6G-/CD11c+, нейтрофилы Ly6G+/CD11b+/CD11c-, Т-клетки CD3+ /CD4+ или CD3+/CD8+. Между мышами WT и ASC -/- не наблюдалось значительного снижения общего количества CD45 hi , DC, нейтрофилов или Т-клеток. Значения выражены как средние ± SEM (**P <0,01).

https://дои.org/10.1371/journal.ppat.1009285.g005

Значительно повышенная инфильтрация макрофагов у мышей дикого типа согласуется с повышенными уровнями CCL6, обнаруженными на 3-й день после заражения на рис. 4D. Эти результаты показывают, что ASC имеет решающее значение для рекрутирования макрофагов в ЦНС во время HSE.

Обсуждение

Мы сообщаем, что адапторный белок воспаления, ASC, способствует смертности в мышиной модели HSE. Напротив, мыши с дефицитом компонентов сенсора воспаления NLRP3 и AIM2 не отличались по выживаемости от мышей дикого типа.Мы продемонстрировали, что ASC-зависимые инфламмасомы способствуют смертности, не влияя на репликацию вируса. ASC также имеет решающее значение для образования провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-18, что позволяет предположить, что ASC-зависимые инфламмасомы вносят основной вклад в высвобождение этих цитокинов во время HSE. Мы идентифицировали микроглию как первичные медиаторы воспалительного ответа in vivo и в органотипической модели культуры срезов головного мозга инфекции HSV-1. Используя как in vitro инфекции глиальных культур, так и нашу модель HSE in vivo, мы обнаружили, что экспрессия макрофагального хемоаттрактанта CCL6 зависит от ASC-зависимых инфламмасом.Наконец, снижение CCL6 у мышей ASC -/- было связано с уменьшением инфильтрации макрофагов в ЦНС во время инфекции.

ASC является ключевым адаптером для канонических инфламмасом, выступая в качестве моста между сенсором и прокаспазой-1 через свои домены PYD (пириновый домен) и CARD (домен активации и рекрутирования каспазы) соответственно [35]. Было показано, что инфекция ВПГ-1 in vitro активирует некоторые из этих инфламмасом, которые действуют через ASC, включая NLRP3, AIM2 и IFI16 [18, 19, 21], но степень, в которой они способствуют заболеванию в ЦНС, была неизвестна.Роль инфламмасом в патогенезе ВПГ-1 in vivo была в значительной степени ограничена мышиными моделями инфекции роговицы ВПГ-1. Предыдущие исследования показали, что инфекция роговицы мышей NLRP3 -/- приводит к более тяжелому иммунопатогенезу [23], и что инфекция роговицы HSV-1 индуцирует инфламмасомы NLRP3, NLRP12 и IFI16 [36]. Предыдущее исследование показало, что мыши с дефицитом IL-1β были более восприимчивы к интраназальной модели инфекции HSV-1 [25]. Это несоответствие, вероятно, связано с путем заражения, при этом IL-1β важен для предотвращения нейроинвазии или ограничения периферической репликации в слизистой оболочке носа, но наносит ущерб, когда вирус получает доступ к ЦНС.В внутричерепной модели HSE наше исследование предполагает, что множественные ASC-зависимые инфламмасомы вносят вклад в патогенез, вызывая чрезмерное нейровоспаление в ЦНС, но что ни NLRP3, ни AIM2 сами по себе не объясняют различий в выживании или продукции цитокинов. Интересно, что дефицит NLRP3 приводил к более высоким уровням IL-1β в головном мозге позже при инфекции, что указывает на регуляторную роль NLRP3 в изменении активности каспазы-1, а не просто на усиление активации IL-1β в ответ на иммунный стимул.Наше исследование предполагает сложную иммуномодулирующую роль ASC в регуляции множественных инфламмасом в головном мозге без доминирующего компонента PRR.

Важно отметить, что в нашем исследовании микроглия была идентифицирована как ключевой медиатор воспалительного ответа при СГЭ, добавляя к растущим данным о том, что микроглия вносит вклад в патологию при инфекции ЦНС, вызванной ВПГ-1 [37]. Мы также продемонстрировали подавление хемокина CCL6 в культурах глии ASC -/- и в головном мозге мышей ASC -/- на 3-й день после заражения.Интересно, что CCL6 был повышен как у мышей WT, так и у мышей ASC -/- на 1-й день после заражения. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что после первоначальной активации на ранних стадиях инфекции ASC-зависимые инфламмасомы значительно влияют на инфильтрацию иммунных клеток на более поздних стадиях инфекции, регулируя продукцию CCL6, и способствуют пролонгированному нейровоспалительному ответу. CCL6 был описан как хемоаттрактант моноцитов через его предполагаемый рецептор, хемокиновый рецептор 1 CC-типа (CCR1) [30,31].В нескольких исследованиях изучали CCL6 в головном мозге, но сообщалось, что он экспрессируется в микроглии крыс, а не в астроцитах [38]. В мышиной модели вируса венесуэльского лошадиного энцефалита более вирулентные штаммы вируса индуцируют большую экспрессию CCL6 в головном мозге и последующую инфильтрацию мононуклеарных клеток в паренхиму [39]. Эти исследования согласуются с нашим обнаружением снижения инфильтрации макрофагов в головном мозге у мышей ASC -/- , совпадающего со сниженным уровнем CCL6, и могут представлять собой общий механизм рекрутирования адаптивных иммунных клеток в головной мозг после нейротропной вирусной инфекции.В совокупности наши данные свидетельствуют о том, что активация микроглиальных инфламмасом может служить ключевой связью между ранним врожденным иммунным ответом на ВПГ-1 и длительным нейровоспалением за счет рекрутирования инфильтрирующих лейкоцитов.

Хотя компоненты врожденной иммунной системы имеют решающее значение для контроля репликации ВПГ-1 в головном мозге [3,4], наше исследование показало, что ASC-зависимые инфламмасомы не способствуют контролю репликации вируса. Улучшенная выживаемость мышей ASC -/- на фоне сниженных воспалительных маркеров без влияния на репликацию вируса указывает на то, что инфламмасомы являются иммунопатогенными при СГЭ.Эти результаты согласуются с исследованиями, демонстрирующими ключевую роль инфламмасом в развитии нейровоспаления в ответ на другие вирусные инфекции ЦНС [24,40,41]. При инфекции ВПГ-1 повреждение нейронов может быть вызвано как репликацией вируса, так и патологическим воспалением, что также может в конечном итоге способствовать эксайтотоксичности, пироптозу и некроптозу [5,42]. В результате ответ хозяина на инфекцию представляет собой точный баланс между соответствующим иммунным ответом и длительным нейровоспалением.Иммунопатология клинически проявляется при стандартном использовании ацикловира, противовирусного терапевтического средства, направленного на контроль репликации ВПГ, что значительно снижает смертность, но не неврологическую заболеваемость после ВПГ-энцефалита [43]. Это говорит о том, что иммунный ответ хозяина значительно влияет на неврологические исходы при СГЭ, помимо прямых пагубных последствий репликации вируса. Наши данные свидетельствуют о том, что нацеливание на активацию инфламмасом при СГЭ может сместить баланс в сторону менее пагубного иммунного ответа и улучшить исходы после инфицирования ВПГ.

Текущая противовирусная терапия ВПГ-1 нацелена на репликацию вируса, но было предложено дополнительное лечение кортикостероидами для противодействия иммунопатологии [44]. Тем не менее, рациональное нацеливание на иммунные пути дает возможность предотвратить вредное воспаление без нарушения элиминации вируса, предлагая синергетический подход к лечению широкого спектра вирусных заболеваний. Нацеливание на компоненты воспаления изучалось как при нейровоспалительных заболеваниях, так и на доклинических моделях вирусных заболеваний.Например, было показано, что антагонист рецептора IL-1, анакинра, эффективен в улучшении результатов в мышиных моделях плацентарной дисфункции, вызванной вирусом Зика, и артрита, вызванного вирусом Чикунгунья [45,46]. Анакинра также использовалась для лечения пациентов с болезнью Бехчета, воспалительным заболеванием с поражением ЦНС [47], и было продемонстрировано, что он преодолевает гематоэнцефалический барьер у людей [48]. Этот препарат и другие, которые аналогичным образом воздействуют на передачу сигналов IL-1, могут представлять собой лучшую стратегию для избирательного воздействия на вредное воспаление во время инфекции HSV-1.Наше исследование предполагает, что воздействие на инфламмасомный ответ может предотвратить вредное воспаление с потенциалом улучшения выживаемости независимо от элиминации вируса при СГЭ.

Материалы и методы

Заявление об этике

Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здравоохранения. Протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Северо-Западного университета (протокол IS00003204).Анестезия при внутричерепных инфекциях проводилась изофлураном. Эвтаназию проводили с помощью CO2 и смещения шейки матки.

Клетки и вирус

HSV-1 KOS размножали в клетках Vero и хранили при -80°C до использования. Анализ бляшек использовали для определения титра вируса, как описано ранее [49]. Первичные астроциты и микроглию выделяли как у самцов, так и у самок мышей WT или ASC -/- C57BL/6J в возрасте 6–8 недель, сначала создавая суспензии отдельных клеток с использованием набора для диссоциации нервной ткани (P) (Miltenyi Biotec, Сан-Франциско). Диего, Калифорния) в соответствии с ручным протоколом диссоциации производителя.Затем последовательно выделяли астроциты и микроглию с использованием наборов микробусин анти-ACSA-2 и анти-CD11b (Miltenyi Biotec) в соответствии с протоколом производителя. Первичные клетки выдерживали в полной среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM + 10% FBS + 1% L-глутамат + пенициллин/стрептомицин) в течение одной недели до инфицирования.

ВПГ-1 Энцефалит, модель

Вирусные запасы разводили до соответствующей концентрации в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1% сыворотки, инактивированной нагреванием, и 0.1% глюкоза (PBS-GCS). Чтобы контролировать возможную иммунную стимуляцию клеточным дебрисом в вирусном инокуляте, запасы для ложных инфекций готовили путем разбавления супернатанта из ложно инфицированных клеток Vero до того же коэффициента разведения, что и вирусные запасы с PBS-GCS. Мыши дикого типа C57BL/6J были получены от Jackson Laboratories (#000664). Мыши C57BL/6J NLRP3 -/- и ASC -/- были получены от Karen Ridge (Northwestern University) и Christian Stehlik (Northwestern University) соответственно и были описаны ранее [50,51].Мыши C57BL/6J AIM2 -/- были получены от Jackson Laboratories (#013144). Перед заражением мышей анестезировали изофлураном.

Вирусный инокулят или разбавленный супернатант Vero вводили в объеме 10 мкл с помощью поршневого шприца и иглы 26-го калибра с защитным приспособлением для иглы. Иглу вводили через правую теменную кость латеральнее стреловидного шва и на равном расстоянии от лямбды и брегмы. Для экспериментов на выживание мышей заражали 3×10 4 БОЕ KOS HSV-1 и ежедневно взвешивали в течение 14-дневного экспериментального периода.Мышей забивали, если они теряли 30% своего исходного веса. Для экспериментов по титрированию тканей во времени мышей инфицировали, как описано выше, и умерщвляли в соответствующий момент времени. Мозг собирали для титрования вируса при гибели или в конце эксперимента и гомогенизировали в 1 мл DMEM, содержащей пенициллин/стрептомицин, и обрабатывали ультразвуком.

ИФА

Для ELISA мозговой ткани мышам вводили 3 x 10 4 БОЕ HSV-1 KOS и умерщвляли в соответствующий момент времени.Образцы представляли собой гомогенаты цельного мозга. Наборы IL-1β (BMS6002), IL-18 (BMS618-3) и CCL6 (EMCCL6) ELISA (Thermo Fisher) использовали в соответствии с инструкциями производителя.

Проточная цитометрия

Мышей инокулировали 3 x 10 4 БОЕ HSV-1 KOS или ложноинфицировали и умерщвляли путем транскардиальной перфузии PBS на 3-й день после заражения. Мозг диссоциировали с использованием набора для диссоциации нервной ткани (P) (Miltenyi Biotec). Для подсчета инфильтрирующих лейкоцитов клетки сначала обрабатывали антителом TruStain FcX к CD16/32 (Fc block-BioLegend; 93) перед окрашиванием следующими антителами: Ly6G APC-Cy7 (BioLegend; RB6-8C5), CD11c APC (BioLegend; ; N418) и CD11b BV421 (BD; M1/70).Проточную цитометрию выполняли на FACS CantoII (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) и анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo 10.1 (Ashland, OR, USA).

Для анализа флуоресцентно-меченого ингибитора активности каспаз (FLICA) клеточные суспензии сначала инкубировали с разведением 1:1000 набора Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific) перед инкубацией с реагентом FAM-FLICA в соответствии с протокол производителя (ImmunoChemistry Technologies). Перед анализом клетки обрабатывали Fc-блокирующим реагентом (Fc block-BioLegend; 93) и окрашивали следующими антителами: ACSA-2 PE (Miltenyi Biotec; REA969), CD45 PerCP-Cy 5.5 (BD Biosciences; 30-F11) и CD11b PE-Cy7 (eBioscience; M1/70). Отбор положительных популяций был основан на образцах флуоресценции минус один контроль (FMO).

Глиальные кокультуральные инфекции

1,5 x 10 5 Клетки были инфицированы при множественности инфекций 5 с помощью KOS HSV-1, разведенного в 0,3 мл PBS-GCS. Только PBS-GCS использовали для имитации инфекций. Клетки инкубировали с инокулятом и осторожно встряхивали при 37°С в течение 2 часов. Затем инокулят отсасывали и клетки дважды промывали PBS перед заменой питательной среды.Клеточная РНК была выделена через 12 часов с использованием реагента TRIzol (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя и количественно определена с помощью NanoDrop 1000.

Матрица цитокинов и хемокинов RT-PCR

Клеточная РНК из глиальных клеточных инфекций подвергалась обратной транскрипции с использованием набора RT 2 First Strand Kit (QIAGEN) с 0,4 мкг РНК на образец. Относительная экспрессия 84 провоспалительных цитокинов и хемокинов была затем количественно определена с использованием RT 2 Profiler PCR Array PAMM-011Z (QIAGEN).Экспрессию гена анализировали с помощью программного обеспечения для анализа RT 2 Profiler PCR Array из Центра анализа данных GeneGlobe с использованием метода ΔΔCt с отсечкой Ct, равной 35. Экспрессию нормализовали по гену домашнего хозяйства Gapdh . Гены, для которых менее трех образцов на группу имели обнаруживаемые уровни транскрипта, были исключены из анализа. Значения P рассчитывали на основе двустороннего t-критерия Стьюдента для 2 -ΔCt значений для каждого гена, и p<0,5 считалось значимым.Относительную экспрессию генов визуализировали с помощью свободно доступного онлайн-инструмента Heatmapper [52].

Органотипические культуры срезов головного мозга

Культуры срезов мозга были приготовлены из новорожденных мышей P6-10, как описано ранее [3]. Мембраны со срезами головного мозга помещали в шестилуночные планшеты с 1 мл фильтровальной культуральной среды [50% (об./об.) минимально необходимой среды, 25% (об./об.) HBSS, 25% (об./об.) инактивированной нагреванием лошадиной среды. сыворотка, 0,044% NaHCO 3 , 2 мМ глутамина, 10 ЕД/мл пенициллина].Срезы культивировали в течение 24 часов, а затем переносили на фильтрующую культуральную среду, содержащую либо 25 мг/мл клодронат-содержащих липосом, либо эквивалентную концентрацию пустых липосом (Encapsula NanoSciences). Затем срезы культивировали в течение шести дней в средах, содержащих клодронат, или в средах с пустыми липосомами, при этом среды менялись каждые два дня. Через шесть дней в культуре, содержащей липосомы, срезы инфицировали 10 6 БОЕ HSV-1 KOS в 1 мл PBS-GCS. Через два часа инокулят вируса отсасывали, а мембраны переносили на свежую фильтрующую культуральную среду.Среду для анализа ELISA собирали через 48 часов после инфицирования.

Статистика

Все статистические данные рассчитаны с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7.0. Для экспериментов на выживаемость был проведен логранговый анализ с поправкой Бонферрони для множественных сравнений. Вирусные титры и цитокины анализировали с использованием множественных t-тестов с поправкой Холма-Сидака для множественных сравнений. Результаты FLICA были проанализированы с использованием двухстороннего дисперсионного анализа с тестом множественных сравнений Тьюки. Результаты массива экспрессии генов были проанализированы с использованием метода дельта-дельта Ct, при этом значимые результаты были определены с помощью двусторонних t-тестов 2 -ΔCt значений для каждого гена.Подсчет клеток с помощью проточной цитометрии анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с тестом множественных сравнений Даннета.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Нормализованная относительная экспрессия генов в глиальных совместных культурах.

Тепловая карта нормализованной относительной экспрессии генов провоспалительных цитокинов и хемокинов по z-показателю для каждого состояния культуры. Ccl6 и Il1rn выделены как имеющие значительные различия между группами.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009285.s001

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории Longnecker, особенно Нанетт Сусмарски, за ее опыт работы с клеточными культурами. Мы также благодарим Christian Stehlik за предоставление мышей с нокаутом ASC и Karen Ridge за предоставление мышей с нокаутом NLRP3, используемых в исследованиях.

Каталожные номера

  1. 1. Джордж Б.П., Шнайдер Э.Б., Венкатесан А. Уровень госпитализации от энцефалита и стационарная смертность в США, 2000–2010 гг.ПЛОС Один. 2014;9(9):e104169. Эпб 2014/09/06. пмид: 25192177; Центральный PMCID в PubMed: PMC4156306.
  2. 2. Сили У, Кая А, Мерт А, Группа ХСВЭС. Энцефалит, вызванный вирусом простого герпеса: клиника, диагностика и исход у 106 взрослых пациентов. Джей Клин Вирол. 2014;60(2):112–8. Эпб 2014/04/29. пмид: 24768322.
  3. 3. Wilcox DR, Muller WJ, Longnecker R. Таргетинг HSV на фосфатазу хозяина PP1alpha необходим для диссеминированного заболевания у новорожденных и способствует патогенезу в головном мозге.Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112(50):E6937–44. Эпб 2015/12/02. пмид: 26621722; Центральный PMCID в PubMed: PMC4687582.
  4. 4. Уилкокс Д.Р., Фолмсби С.С., Мюллер В.Дж., Лонгнекер Р. Реакция интерферона I типа определяет различия в восприимчивости сосудистого сплетения у новорожденных и взрослых при энцефалите, вызванном вирусом простого герпеса. мБио. 2016;7(2):e00437–16. Эпаб 14.04.2016. пмид: 27073094; Центральный PMCID в PubMed: PMC4959527.
  5. 5. Лундберг П., Рамакришна С., Браун Дж., Тышка Дж. М., Хамамура М., Хинтон Д. Р. и др.Иммунный ответ на инфекцию вирусом простого герпеса типа 1 у восприимчивых мышей является основной причиной патологии центральной нервной системы, приводящей к фатальному энцефалиту. Дж Вирол. 2008;82(14):7078–88. Эпб 2008/05/16. пмид: 18480436; Центральный PMCID в PubMed: PMC2446972.
  6. 6. Marques CP, Cheeran MC, Palmquist JM, Hu S, Urban SL, Lokensgard JR. Длительная активация клеток микроглии и инфильтрация лимфоцитов после экспериментального герпесного энцефалита. Дж Иммунол. 2008;181(9):6417–26.Эпублик 23.10.2008. пмид: 18941232; Центральный PMCID в PubMed: PMC2614272.
  7. 7. Аурелиус Э., Андерссон Б., Форсгрен М., Сколденберг Б., Страннегард О. Цитокины и другие маркеры интратекального иммунного ответа у больных энцефалитом простого герпеса. J заразить дис. 1994;170(3):678–81. Эпб 1994/09/01. пмид:8077727.
  8. 8. Хиральдо Д., Уилкокс Д.Р., Лонгнекер Р. Реакция интерферона типа I и возрастная восприимчивость к вирусной инфекции простого герпеса. ДНК-клеточная биол.2017;36(5):329–34. Эпб 2017/03/10. пмид: 28278385; Центральный PMCID в PubMed: PMC5421632.
  9. 9. Броз П., Диксит В.М. Инфламмасомы: механизм сборки, регуляции и передачи сигналов. Нат Рев Иммунол. 2016;16(7):407–20. Эпаб 14.06.2016. пмид: 272.
  10. 10. Fann DY, Lee SY, Manzanero S, Tang SC, Gelderblom M, Chunduri P, et al. Внутривенный иммуноглобулин подавляет опосредованную воспалением NLRP1 и NLRP3 гибель нейронов при ишемическом инсульте. Клеточная смерть Дис. 2013;4:e790.Эпб 2013/09/07. пмид: 24008734; Центральный PMCID в PubMed: PMC3789184.
  11. 11. Gris D, Ye Z, Iocca HA, Wen H, Craven RR, Gris P, et al. NLRP3 играет критическую роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, опосредуя ответы Th2 и Th27. Дж Иммунол. 2010;185(2):974–81. Эпб 2010/06/25. пмид: 20574004; Центральный PMCID в PubMed: PMC3593010.
  12. 12. Heneka MT, Kummer MP, Latz E. Активация врожденного иммунитета при нейродегенеративных заболеваниях. Нат Рев Иммунол.2014;14(7):463–77. Эпаб 2014/06/26. пмид: 24962261.
  13. 13. Чжан Х., Луо Дж., Алкорн Дж. Ф., Чен К., Фан С., Пилевски Дж. и др. Инфламмасома AIM2 имеет решающее значение для вызванного гриппом повреждения легких и смертности. Дж Иммунол. 2017;198(11):4383–93. Эпаб 2017/04/21. пмид: 28424239; Центральный PMCID в PubMed: PMC5439025.
  14. 14. Ichinohe T, Lee HK, Ogura Y, Flavell R, Iwasaki A. Распознавание инфламмасомами вируса гриппа необходимо для адаптивных иммунных реакций. J Эксперт Мед.2009;206(1):79–87. Эпб 14.01.2009. пмид: 1

    71; Центральный PMCID в PubMed: PMC2626661.
  15. 15. He Z, Chen J, Zhu X, An S, Dong X, Yu J и др. Активация воспаления NLRP3 опосредует воспаление, связанное с вирусом Зика. J заразить дис. 2018; 217(12):1942–51. Эпб 2018/03/09. пмид: 29518228.
  16. 16. Кошик Д.К., Гупта М., Кумават К.Л., Басу А. Инфламмасома NLRP3: ключевой медиатор нейровоспаления при японском энцефалите мышей. ПЛОС Один. 2012;7(2):e32270. Эпб 2012/03/07.пмид: 22393394; Центральный PMCID в PubMed: PMC32
    .
  17. 17. Чен В., Фу С.С., Зайд А., Тенг Т.С., Эрреро Л.Дж., Вольф С. и др. Специфическое ингибирование NLRP3 при болезни чикунгунья указывает на роль инфламмасом в воспалении, вызванном альфавирусом. Нат микробиол. 2017;2(10):1435–45. Эпб 2017/08/30. пмид: 28848230.
  18. 18. Johnson KE, Chikoti L, Chandran B. Инфекция, вызванная вирусом простого герпеса 1, вызывает активацию и последующее ингибирование инфламмасом IFI16 и NLRP3.Дж Вирол. 2013;87(9):5005–18. Эпб 2013/02/22. пмид: 23427152; Центральный PMCID в PubMed: PMC3624293.
  19. 19. Марузуру Ю., Ичинохе Т., Сато Р., Мияке К., Окано Т., Судзуки Т. и др. Вирус простого герпеса 1 VP22 ингибирует AIM2-зависимую активацию воспаления, чтобы обеспечить эффективную репликацию вируса. Клеточный микроб-хозяин. 2018;23(2):254–65 e7. Эпб 2018/02/16. пмид: 29447697.
  20. 20. Караба А.Х., Фигероа А., Массаччези Г., Ботто С., ДеФилиппис В.Р., Кокс А.Л. Активация инфламмасом вируса простого герпеса типа 1 в провоспалительных макрофагах человека зависит от NLRP3, ASC и каспазы-1.ПЛОС Один. 2020;15(2):e0229570. Эпаб 2020/02/27. пмид:32101570; Центральный PMCID в PubMed: PMC7043765.
  21. 21. Ансари М.А., Датта С., Веттил М.В., Датта Д., Икбал Дж., Кумар Б. и др. Распознавание генома герпесвируса, индуцированное ацетилированием ядерного IFI16, необходимо для его цитоплазматической транслокации, воспалительного ответа и ответов IFN-бета. PLoS Патог. 2015;11(7):e1005019. Эпб 2015/07/03. пмид: 26134128; Центральный PMCID в PubMed: PMC4489722.
  22. 22. Wang W, Hu D, Wu C, Feng Y, Li A, Liu W и др.STING способствует локализации NLRP3 в ER и облегчает деубиквитинирование NLRP3 для активации инфламмасомы при инфицировании HSV-1. PLoS Патог. 2020;16(3):e1008335. Эпаб 2020/03/19. пмид:32187211; Центральный PMCID в PubMed: PMC7080238.
  23. 23. Хименес Ф., Бхела С., Догра П., Харви Л., Варанаси С.К., Джагги У. и др. Инфламмасома NLRP3 играет защитную роль против вирусного иммунопатологического поражения. Дж. Лейкок Биол. 2016;99(5):647–57. Эпублик 2015/10/31. пмид: 26516184; Центральный PMCID в PubMed: PMC4831481.
  24. 24. de Sousa JR, Azevedo R, Martins Filho AJ, de Araujo MTF, Cruz E, Vasconcelos BCB и др. Активация инфламмасом in situ приводит к серьезному повреждению центральной нервной системы в случаях фатальной микроцефалии, вызванной вирусом Зика. Цитокин. 2018;111:255–64. Эпб 2018/09/11. пмид:30199767.
  25. 25. Sergerie Y, Rivest S, Boivin G. Фактор некроза опухоли-альфа и бета-интерлейкин-1 играют решающую роль в устойчивости к летальному энцефалиту, вызванному вирусом простого герпеса.J заразить дис. 2007;196(6):853–60. Эпб 2007/08/19. пмид: 17703415.
  26. 26. Перри В.Х., Николл Дж.А., Холмс С. Микроглия при нейродегенеративных заболеваниях. Нат Рев Нейрол. 2010;6(4):193–201. Эпб 2010/03/18. пмид: 20234358.
  27. 27. Ли С.В., де Риверо Ваккари Дж.П., Труттнер Дж.С., Дитрих В.Д., Кин Р.В. Роль активации микроглиальных инфламмасом в пироптотической гибели клеток после проникающей черепно-мозговой травмы. J Нейровоспаление. 2019;16(1):27. Эпб 2019/02/10.пмид:30736791; Центральный PMCID в PubMed: PMC6367831.
  28. 28. Шеппард О., член парламента Коулман, Даррант К.С. Липополисахарид-индуцированное нейровоспаление индуцирует пресинаптические нарушения за счет прямого действия на ткани головного мозга с участием интерлейкина 1 бета, полученного из микроглии. J Нейровоспаление. 2019;16(1):106. Эпаб 20.05.2019. пмид:31103036; Центральный PMCID в PubMed: PMC6525970.
  29. 29. Райнерт Л.С., Лопусна К., Винтер Х., Сан С., Томсен М.К., Нандакумар Р. и соавт. Обнаружение HSV-1 путем cGAS-STING в микроглии управляет противовирусной защитой в ЦНС.Нац коммун. 2016;7:13348. Эпублик 11.11.2016. пмид: 27830700; Центральный PMCID в PubMed: PMC5109551.
  30. 30. Лафлер А.М., Лукач Н.В., Кункель С.Л., Мацукава А. Роль хемокина CC CCL6/C10 в качестве хемоаттрактанта моноцитов при остром перитоните у мышей. Медиаторы воспаления. 2004;13(5–6):349–55. Эпб 2005/03/17. пмид: 15770051; Центральный PMCID в PubMed: PMC1781581.
  31. 31. Ма Б., Чжу З., Гомер Р.Дж., Джерард С., Стритер Р., Элиас Дж.А. Хемокин C10/CCL6 и CCR1 играют решающую роль в патогенезе IL-13-индуцированного воспаления и ремоделирования.Дж Иммунол. 2004; 172 (3): 1872–81. Эпб 2004/01/22. пмид: 14734772.
  32. 32. Garlanda C, Dinarello CA, Mantovani A. Семейство интерлейкинов-1: назад в будущее. Иммунитет. 2013;39(6):1003–18. Эпублик 18.12.2013. пмид: 24332029; Центральный PMCID в PubMed: PMC3933951.
  33. 33. Уэст Т.Р., Карр Д.Дж. Нарушение регуляции передачи сигналов CXCR3 из-за дефицита CXCL10 ухудшает противовирусный ответ на инфекцию, вызванную вирусом простого герпеса 1. Дж Иммунол. 2008;181(11):7985–93. Эпублик 20.11.2008.пмид: 190; Центральный PMCID в PubMed: PMC2596651.
  34. 34. Zimmermann J, Hafezi W, Dockhorn A, Lorentzen EU, Krauthausen M, Getts DR, et al. Повышенный клиренс вируса и снижение инфильтрации лейкоцитов при экспериментальном герпесном энцефалите после интраназального заражения мышей с дефицитом CXCR3. J Нейровирол. 2017;23(3):394–403. Эпб 2017/01/25. пмид: 28116674.
  35. 35. де Альба Э. Структура, взаимодействие и самосборка ASC-зависимых инфламмасом. Арх Биохим Биофиз.2019; 670:15–31. Эпб 2019/06/04. пмид:31152698.
  36. 36. Кулон П.Г., Дханушкоди Н., Пракаш С., Сривастава Р., Рой С., Аломари Н.И. и соавт. Индукция инфламмасом NLRP3, NLRP12 и IFI16 и активация каспазы-1, вызванная вирулентными штаммами HSV-1, связаны с тяжелым воспалительным герпетическим заболеванием роговицы. Фронт Иммунол. 2019;10:1631. Эпб 2019/08/02. пмид:31367214; Центральный PMCID в PubMed: PMC6644090.
  37. 37. Wang Y, Jia J, Wang Y, Li F, Song X, Qin S и др.Роль микроглиального иммунного ответа, вызванного инфекцией ВПГ-1, при заболеваниях ЦНС: друзья или враги? Crit Rev Microbiol. 2019;45(5–6):581–94. Эпб 2019/09/13. пмид:31512533.
  38. 38. Канно М., Судзуки С., Фудзивара Т., Ёкояма А., Сакамото А., Такахаши Х. и др. Функциональная экспрессия CCL6 крысиной микроглией: возможная роль CCL6 в межклеточной коммуникации. J Нейроиммунол. 2005; 167 (1–2): 72–80. Эпубликовано 10 августа 2005 г. пмид: 16087246.
  39. 39. Гупта П., Шарма А., Хан Дж., Ян А., Бхомия М., Ноллманн-Ритчел Б. и др.Дифференциальные ответы генов-хозяев на инфекцию нейровирулентными и частично нейровирулентными штаммами вируса венесуэльского лошадиного энцефалита. BMC Infect Dis. 2017;17(1):309. Эпб 2017/04/28. пмид: 28446152; Центральный PMCID в PubMed: PMC5405508.
  40. 40. Уолш Дж.Г., Рейнке С.Н., Мамик М.К., Маккензи Б.А., Майнгат Ф., Брэнтон В.Г. и др. Быстрая активация воспалительных процессов в микроглии способствует заболеванию головного мозга при ВИЧ/СПИДе. Ретровирусология. 2014;11:35. Эпб 2014/06/03. пмид: 24886384; Центральный PMCID в PubMed: PMC4038111.
  41. 41. Wang W, Li G, De W, Luo Z, Pan P, Tian M, et al. Вирусная инфекция Зика вызывает воспалительные реакции хозяина, способствуя сборке инфламмасомы NLRP3 и секреции интерлейкина-1бета. Нац коммун. 2018;9(1):106. Эпублик от 11.01.2018. пмид: 29317641; Центральный PMCID в PubMed: PMC5760693.
  42. 42. Perkins D, Gyure KA, Pereira EF, Aurelian L. Энцефалит, вызванный вирусом простого герпеса типа 1, имеет апоптотический компонент, связанный с активацией N-концевой киназы c-Jun.J Нейровирол. 2003;9(1):101–11. Эпб 2003/02/15. пмид: 12587073.
  43. 43. Кимберлин Д.В., Лин Сай Фау – Джейкобс Р.Ф., Джейкобс Р.Ф. Фау – Пауэлл Д.А., Пауэлл Да Фау – Кори Л., Кори Л. Фау – Грубер В.К., Грубер В.К. Фау – Ратор М. и соавт. Безопасность и эффективность высоких доз ацикловира внутривенно при лечении неонатальных инфекций, вызванных вирусом простого герпеса. (1098–4275 (электронный)).
  44. 44. Ramos-Estebanez C, Lizarraga KJ, Merenda A. Систематический обзор роли дополнительных кортикостероидов при энцефалите, вызванном вирусом простого герпеса: является ли время критическим для безопасности и эффективности? Антивир Тер.2014;19(2):133–9. Эпб 2013/09/07. пмид: 24009096.
  45. 45. Lei J, Vermillion MS, Jia B, Xie H, Xie L, McLane MW и др. Терапия антагонистами рецептора IL-1 смягчает плацентарную дисфункцию и перинатальные повреждения после инфицирования вирусом Зика. Взгляд JCI. 2019;4(7). Эпб 2019/04/05. пмид:30944243; Центральный PMCID в PubMed: PMC6483652.
  46. 46. Вольф С., Тейлор А., Зайд А., Фрейтас Дж., Эрреро Л.Дж., Рао С. и др. Ингибирование передачи сигналов интерлейкина-1бета с помощью Anakinra демонстрирует критическую роль потери костной массы в экспериментальных артритогенных альфавирусных инфекциях.Артрит Ревматолог. 2019;71(7):1185–90. Эпаб 2019/02/13. пмид:30747500.
  47. 47. Кантарини Л., Витале А., Скалини П., Динарелло К.А., Риганте Д., Франческини Р. и др. Лечение анакинрой лекарственно-устойчивой болезни Бехчета: серия случаев. Клин Ревматол. 2015;34(7):1293–301. Эпублик 2013/12/07. пмид: 24305945.
  48. 48. Гольдбах-Мански Р., Дейли Н.Дж., Канна С.В., Гелаберт А., Джонс Дж., Рубин Б.И. и соавт. Неонатальное мультисистемное воспалительное заболевание, реагирующее на ингибирование интерлейкина-1бета.N Engl J Med. 2006;355(6):581–92. Эпублик 11.08.2006. пмид: 16899778; Центральный PMCID в PubMed: PMC4178954.
  49. 49. Эдвардс Р.Г., Копп С.Дж., Караба А.Х., Уилкокс Д.Р., Лонгнекер Р. Медиатор проникновения герпесвируса в радиационно-устойчивые клеточные линии способствует патогенезу глазного вируса простого герпеса 1 независимым от проникновения образом. мБио. 2015;6(5):e01532–15. Эпублик 23.10.2015. пмид: 26489863; Центральный PMCID в PubMed: PMC4620471.
  50. 50. Мариатасан С., Ньютон К., Монак Д.М., Вучич Д., Френч Д.М., Ли В.П. и др.Дифференциальная активация инфламмасомы адаптерами каспазы-1 ASC и Ipaf. Природа. 2004;430(6996):213–8. Эпублик 11.06.2004. пмид: 151

    .
  51. 51. Мариатасан С., Вайс Д.С., Ньютон К., Макбрайд Дж., О’Рурк К., Руз-Гирма М. и другие. Криопирин активирует инфламмасому в ответ на токсины и АТФ. Природа. 2006; 440(7081):228–32. Эпублик 13.01.2006. пмид: 16407890.
  52. 52. Бабицкий С., Арндт Д., Марку А., Лян И., Грант Дж. Р., Мачеевский А. и др. Heatmapper: онлайн-картирование тепла для всех.Нуклеиновые Кислоты Res. 2016;44(Выч.1):Выч.147–53. Эпб 2016/05/18. пмид: 271

    ; Центральный PMCID в PubMed: PMC4987948.

%PDF-1.4 % 733 0 объект > эндообъект внешняя ссылка 733 400 0000000016 00000 н 0000012868 00000 н 0000012989 00000 н 0000016129 00000 н 0000016241 00000 н 0000016365 00000 н 0000016402 00000 н 0000016516 00000 н 0000018549 00000 н 0000020489 00000 н 0000022512 00000 н 0000024605 00000 н 0000026702 00000 н 0000026826 00000 н 0000026950 00000 н 0000027074 00000 н 0000029205 00000 н 0000029671 00000 н 0000030062 00000 н 0000030428 00000 н 0000030820 00000 н 0000030934 00000 н 0000031058 00000 н 0000031329 00000 н 0000031443 00000 н 0000031714 00000 н 0000031830 00000 н 0000032101 00000 н 0000032375 00000 н 0000032499 00000 н 0000032623 00000 н 0000032747 00000 н 0000032871 00000 н 0000032995 00000 н 0000033119 00000 н 0000033243 00000 н 0000033369 00000 н 0000035547 00000 н 0000077899 00000 н 0000079531 00000 н 0000082181 00000 н 0000087785 00000 н 0000092257 00000 н 0000095989 00000 н 0000096026 00000 н 0000099290 00000 н 0000099490 00000 н 0000099690 00000 н 0000100096 00000 н 0000100193 00000 н 0000100268 00000 н 0000100586 00000 н 0000100661 00000 н 0000100979 00000 н 0000101054 00000 н 0000101371 00000 н 0000101446 00000 н 0000101764 00000 н 0000101839 00000 н 0000102156 00000 н 0000102231 00000 н 0000102548 00000 н 0000102623 00000 н 0000102940 00000 н 0000103015 00000 н 0000103332 00000 н 0000103407 00000 н 0000103724 00000 н 0000103799 00000 н 0000104116 00000 н 0000104191 00000 н 0000104508 00000 н 0000104583 00000 н 0000104900 00000 н 0000104975 00000 н 0000105292 00000 н 0000105367 00000 н 0000105684 00000 н 0000105759 00000 н 0000106075 00000 н 0000106150 00000 н 0000106466 00000 н 0000106541 00000 н 0000106857 00000 н 0000106932 00000 н 0000107248 00000 н 0000107323 00000 н 0000107638 00000 н 0000107713 00000 н 0000108028 00000 н 0000108103 00000 н 0000108420 00000 н 0000108495 00000 н 0000108812 00000 н 0000108887 00000 н 0000109205 00000 н 0000109280 00000 н 0000109597 00000 н 0000109672 00000 н 0000109989 00000 н 0000110064 00000 н 0000110378 00000 н 0000110453 00000 н 0000110767 00000 н 0000110842 00000 н 0000111157 00000 н 0000111232 00000 н 0000111547 00000 н 0000111622 00000 н 0000111937 00000 н 0000112012 00000 н 0000112328 00000 н 0000112403 00000 н 0000112720 00000 н 0000112795 00000 н 0000113112 00000 н 0000113187 00000 н 0000113504 00000 н 0000113579 00000 н 0000113896 00000 н 0000113971 00000 н 0000114287 00000 н 0000114362 00000 н 0000114678 00000 н 0000114753 00000 н 0000115069 00000 н 0000115144 00000 н 0000115460 00000 н 0000115535 00000 н 0000115850 00000 н 0000115925 00000 н 0000116240 00000 н 0000116315 00000 н 0000116629 00000 н 0000116704 00000 н 0000117019 00000 н 0000117094 00000 н 0000117409 00000 н 0000117484 00000 н 0000117799 00000 н 0000117874 00000 н 0000118187 00000 н 0000118262 00000 н 0000118576 00000 н 0000118651 00000 н 0000118967 00000 н 0000119042 00000 н 0000119357 00000 н 0000119432 00000 н 0000119747 00000 н 0000119822 00000 н 0000120139 00000 н 0000120214 00000 н 0000120530 00000 н 0000120605 00000 н 0000120921 00000 н 0000120996 00000 н 0000121312 00000 н 0000121387 00000 н 0000121700 00000 н 0000121775 00000 н 0000122090 00000 н 0000122165 00000 н 0000122479 00000 н 0000122554 00000 н 0000122869 00000 н 0000122944 00000 н 0000123260 00000 н 0000123335 00000 н 0000123650 00000 н 0000123725 00000 н 0000124040 00000 н 0000124115 00000 н 0000124430 00000 н 0000124505 00000 н 0000124820 00000 н 0000124895 00000 н 0000125209 00000 н 0000125284 00000 н 0000125599 00000 н 0000125674 00000 н 0000125988 00000 н 0000126063 00000 н 0000126376 00000 н 0000126451 00000 н 0000126765 00000 н 0000126840 00000 н 0000127154 00000 н 0000127229 00000 н 0000127544 00000 н 0000127619 00000 н 0000127934 00000 н 0000128009 00000 н 0000128323 00000 н 0000128398 00000 н 0000128712 00000 н 0000128787 00000 н 0000129100 00000 н 0000129175 00000 н 0000129491 00000 н 0000129566 00000 н 0000129881 00000 н 0000129956 00000 н 0000130272 00000 н 0000130347 00000 н 0000130662 00000 н 0000130737 00000 н 0000131053 00000 н 0000131128 00000 н 0000131443 00000 н 0000131518 00000 н 0000131832 00000 н 0000131907 00000 н 0000132221 00000 н 0000132296 00000 н 0000132614 00000 н 0000132689 00000 н 0000133006 00000 н 0000133081 00000 н 0000133395 00000 н 0000133470 00000 н 0000133785 00000 н 0000133860 00000 н 0000134174 00000 н 0000134249 00000 н 0000134563 00000 н 0000134638 00000 н 0000134953 00000 н 0000135028 00000 н 0000135343 00000 н 0000135418 00000 н 0000135732 00000 н 0000135807 00000 н 0000136122 00000 н 0000136197 00000 н 0000136513 00000 н 0000136588 00000 н 0000136903 00000 н 0000136978 00000 н 0000137294 00000 н 0000137369 00000 н 0000137683 00000 н 0000137758 00000 н 0000138074 00000 н 0000138149 00000 н 0000138463 00000 н 0000138538 00000 н 0000138852 00000 н 0000138927 00000 н 0000139244 00000 н 0000139319 00000 н 0000139634 00000 н 0000139709 00000 н 0000140026 00000 н 0000140101 00000 н 0000140414 00000 н 0000140489 00000 н 0000140804 00000 н 0000140879 00000 н 0000141197 00000 н 0000141272 00000 н 0000141589 00000 н 0000141664 00000 н 0000141981 00000 н 0000142056 00000 н 0000142374 00000 н 0000142449 00000 н 0000142766 00000 н 0000142842 00000 н 0000143161 00000 н 0000143237 00000 н 0000143557 00000 н 0000143633 00000 н 0000143951 00000 н 0000144027 00000 н 0000144346 00000 н 0000144422 00000 н 0000144741 00000 н 0000144817 00000 н 0000145136 00000 н 0000145212 00000 н 0000145531 00000 н 0000145607 00000 н 0000145922 00000 н 0000145998 00000 н 0000146317 00000 н 0000146393 00000 н 0000146710 00000 н 0000146786 00000 н 0000147105 00000 н 0000147181 00000 н 0000147496 00000 н 0000147572 00000 н 0000147891 00000 н 0000147967 00000 н 0000148283 00000 н 0000148359 00000 н 0000148677 00000 н 0000148753 00000 н 0000149068 00000 н 0000149144 00000 н 0000149463 00000 н 0000149539 00000 н 0000149856 00000 н 0000149932 00000 н 0000150252 00000 н 0000150328 00000 н 0000150645 00000 н 0000150721 00000 н 0000151041 00000 н 0000151117 00000 н 0000151433 00000 н 0000151509 00000 н 0000151828 00000 н 0000151904 00000 н 0000152219 00000 н 0000152295 00000 н 0000152611 00000 н 0000152687 00000 н 0000153006 00000 н 0000153082 00000 н 0000153401 00000 н 0000153477 00000 н 0000153796 00000 н 0000153872 00000 н 0000154192 00000 н 0000154268 00000 н 0000154588 00000 н 0000154664 00000 н 0000154983 00000 н 0000155059 00000 н 0000155378 00000 н 0000155454 00000 н 0000155774 00000 н 0000155850 00000 н 0000156169 00000 н 0000156245 00000 н 0000156566 00000 н 0000156642 00000 н 0000156961 00000 н 0000157037 00000 н 0000157356 00000 н 0000157432 00000 н 0000157750 00000 н 0000157826 00000 н 0000158145 00000 н 0000158221 00000 н 0000158540 00000 н 0000158616 00000 н 0000158935 00000 н 0000159011 00000 н 0000159330 00000 н 0000159406 00000 н 0000159727 00000 н 0000159803 00000 н 0000160122 00000 н 0000160198 00000 н 0000160517 00000 н 0000160593 00000 н 0000160907 00000 н 0000160983 00000 н 0000161299 00000 н 0000161375 00000 н 0000161689 00000 н 0000161765 00000 н 0000162080 00000 н 0000162156 00000 н 0000162538 00000 н 0000162614 00000 н 0000162931 00000 н 0000163007 00000 н 0000163390 00000 н 0000163466 00000 н 0000163782 00000 н 0000163858 00000 н 0000164175 00000 н 0000164251 00000 н 0000164567 00000 н 0000164643 00000 н 0000164961 00000 н 0000165037 00000 н 0000165354 00000 н 0000165430 00000 н 0000165747 00000 н 0000165823 00000 н 0000166137 00000 н 0000166213 00000 н 0000166529 00000 н 0000166605 00000 н 0000166921 00000 н 0000166997 00000 н 0000167313 00000 н 0000167389 00000 н 0000167704 00000 н 0000167780 00000 н 0000168097 00000 н 0000168173 00000 н 0000168490 00000 н 0000233149 00000 н 0000008296 00000 н трейлер ]>> startxref 0 %%EOF 1132 0 объект >поток xZ{

жd#iCڃ.

Клиническая фармакология антибиотиков | Американское общество нефрологов

Реферат

Противомикробная фармакология и ее влияние на назначение препаратов довольно сложны. Выбор антибиотика, который будет оптимально лечить инфекцию при минимальных побочных эффектах и ​​развитии резистентности, является только первым шагом, поскольку при его назначении также необходимо учитывать индивидуальные фармакокинетические изменения пациента и фармакодинамические свойства препарата.У пациентов с ХБП могут быть изменения связывания белков, объемов распределения, почечного и непочечного клиренса, что требует корректировки дозы антибиотика для предотвращения развития токсичности. Знание фармакодинамики лекарственного средства, определяемой как взаимосвязь между экспозицией лекарственного средства и антибактериальной эффективностью, дает некоторое представление об оптимальном способе корректировки дозы. Различные фармакодинамические цели, такие как максимизация времени, в течение которого концентрации свободного (несвязанного) лекарства превышают минимальную ингибирующую концентрацию (МПК) для лекарств, зависящих от времени ( e.грамм. , β -лактамы) или максимизация отношения свободного пика к МПК для антибиотиков, зависящих от концентрации (, например, , аминогликозиды), требуют различных стратегий корректировки; например, снижение дозы при сохранении нормальной частоты дозирования или менее частое введение нормальных (или даже более высоких) доз соответственно. У пациентов, получающих гемодиализ, есть и другие важные соображения, касающиеся назначения препаратов. Нефролог или пациент могут предпочесть получать антибиотики, которые можно вводить внутривенно ближе к концу сеанса диализа.Кроме того, новые технологии диализа и фильтры могут увеличить удаление наркотиков больше, чем предполагалось изначально. В этом обзоре будут обсуждаться место в терапии, механизм действия, фармакокинетические, фармакодинамические и другие фармакологические аспекты, возникающие при назначении часто используемых антибиотиков пациентам с хронической болезнью почек или ХПН.

Введение

Инфекции часто встречаются у пациентов с ХБП, особенно с тХПН (1). В когорте пациентов программы Medicare в США, впервые начавших гемодиализ в период с 1996 по 2001 г., 12-месячная частота госпитализаций по поводу инфекции составила 32% (1,2).Оптимизация антибиотикотерапии при ХБП и ХПН часто может быть довольно сложной, поскольку у этих пациентов могут быть изменены фармакокинетические параметры (всасывание, распределение, метаболизм и элиминация) и часто имеется повышенный риск побочных эффектов (3,4). Диализ также требует дополнительных соображений, поскольку существуют периоды повышенного клиренса во время диализа, за которыми следует 48–72 часа относительно небольшого клиренса антибиотиков между сеансами диализа. Кроме того, в 1980-х годах было проведено множество исследований по удалению лекарств с помощью диализа, когда использовались фильтры с низким потоком, а фильтры с высоким потоком (обычно используемые сегодня) рассматривались только как экспериментальные методы лечения (5).

Помимо соображений, связанных с конкретным пациентом и диализом, существуют соображения, связанные с лекарственными препаратами. Изучение фармакодинамики связывает воздействие лекарственного средства с антибактериальной активностью (6) и определяет фармакодинамические параметры, такие как отношение максимальной концентрации (пик) к МИК, процент интервала дозирования, в течение которого концентрации остаются выше МИК (время > МИК), и отношение воздействия препарата к МИК (площадь под кривой [AUC]:МИК), которое хорошо коррелирует с терапевтической эффективностью.Фармакодинамические параметры изображены на кривой зависимости концентрации от времени на рисунке 1. В целом антибиотики можно разделить на киллеры, зависящие от времени, или киллеры, зависящие от концентрации (таблица 1). При дозировании антибиотиков, зависящих от времени (, например, , β -лактамов), важно максимизировать время> МИК, тогда как при дозировании антибиотиков, зависящих от концентрации (, например, , аминогликозиды), отношение пик:МИК является наиболее важный фармакодинамический параметр для оптимизации (6).Таким образом, при корректировке дозы при заболеваниях почек знание фармакодинамических свойств антибиотиков может помочь клиницисту при принятии решения о том, следует ли уменьшить дозу и сохранить постоянную частоту приема (часто предпочтительнее для антибиотиков, зависящих от времени) или оставить дозу такой же и увеличить интервал дозирования (часто предпочтительнее для антибиотиков, зависящих от концентрации).

Рисунок 1.

Фармакодинамические параметры на кривой зависимости концентрации от времени. Peak:MIC — это параметр, который следует оптимизировать для антибиотиков, зависящих от концентрации.Time>MIC — это параметр, который следует оптимизировать для антибиотиков, зависящих от времени.

Таблица 1.

Фармакодинамика распространенных классов антибиотиков (5,6)

Фармакологические соображения, в том числе обсуждение места в терапии, механизма действия, фармакокинетики и фармакодинамики, при назначении часто используемых классов антибиотиков у пациентов с ХБП и ХБП быть пересмотрены.

β -лактамные антибиотики

Пенициллиновые, цефалоспориновые и карбапенемовые антибиотики содержат β -лактамное кольцо и ингибируют последнюю стадию синтеза пептидогликана клеточной стенки бактерий (7) (рис. 2).Индивидуальные спектры активности β -лактамов и часто лечащиеся инфекционные заболевания представлены в таблице 2. Фармакодинамика β -лактамов зависит от времени (6), и поэтому при корректировке этих препаратов для лечения заболеваний почек часто предпочтительнее уменьшить дозу при сохранении интервала дозирования. Интересно, что ХБП на самом деле несколько облегчает достижение фармакодинамических целей с помощью антибиотиков, зависящих от времени, потому что удлинение t 1/2 из β -лактамов у этих пациентов продлевает время, в течение которого концентрации остаются выше МПК.В последние годы была предложена нагрузочная доза с последующей продолжительной или непрерывной инфузией β -лактамов (, например , пиперациллин-тазобактам [8], цефтазидим, цефепим, меропенем и дорипенем [9]), чтобы максимизировать время что концентрации остаются выше MIC.

Рисунок 2.

Механизм действия классов антибиотиков.

Таблица 2.

β -Лактам Спектр действия антибиотиков и лечение инфекционных заболеваний (7)

Если дозы β -лактамов не подобраны должным образом, нарушения центральной нервной системы (ЦНС), такие как спутанность сознания, миоклонус , и могут возникнуть судороги (10).В первую очередь предполагается, что это связано со снижением почечного клиренса, что приводит к более высоким, чем обычно, концентрациям β -лактамов в ЦНС. Характеристики пациентов с уремией, в том числе снижение связывания β -лактамов с белками (что приводит к увеличению свободных фракций препарата), а также вызванные уремией физиологические изменения головного мозга могут предрасполагать пациентов к этим эффектам (10).

Пенициллины

Несмотря на растущую устойчивость к противомикробным препаратам, пенициллины продолжают играть важную роль в современной антибактериальной терапии.Многие пенициллины имеют короткую выработку (обычно около 0,5–1,5 часов у пациентов с нормальной функцией почек) из-за низкого объема распределения в сочетании со значительной почечной канальцевой секрецией (7). Высокая скорость почечной секреции может привести к некоторым интересным трудностям при дозировании. Например, в одном исследовании ампициллина было обнаружено, что шесть пациентов с ГН, у которых был слегка снижен клиренс креатинина, но нормальная канальцевая секреция, нуждались в полных дозах препарата. С другой стороны, у 11 пациентов с нарушением функции почек канальцевая секреция снижалась параллельно с тяжестью заболевания, и пациентам требовались более низкие дозы, чем можно было бы прогнозировать только по снижению клиренса креатинина (11).Авторы пришли к выводу, что необходимы новые методы корректировки дозировки, учитывающие как клубочковую, так и канальцевую функцию. К сожалению, не было разработано никаких клинически практических подходов к индивидуальному дозированию лекарств на основе канальцевой секреции (12).

Пенициллины обычно хорошо переносятся пациентами с заболеваниями почек. Обычно сообщают о реакциях гиперчувствительности, и существует связь между пенициллином и интерстициальным нефритом, но пациенты с заболеванием почек не относятся к группе повышенного риска (10).Пиперациллин-тазобактам, пенициллиновый антибиотик, который обычно не вызывает нефротоксичности, совсем недавно стал вызывать ОПП в сочетании с ванкомицином (13). Однако механизм этой ассоциации остается неясным (13). Пенициллин G, карбенициллин, тикарциллин и ампициллин связаны с нарушением агрегации тромбоцитов, редким побочным эффектом, который может быть более вероятным у пациентов с дисфункцией тромбоцитов, вызванной уремией (7,10).

Цефалоспорины

Одной из ниш цефалоспоринов первого поколения является лечение катетер-ассоциированных бактериемий, вызванных чувствительным к метициллину Staphylococcus aureus (MSSA).Как только становится ясно, что микроорганизм является MSSA, β -лактамные препараты связаны с лучшими результатами, чем терапия ванкомицином (14). Цефазолин является разумным выбором, так как его можно вводить три раза в неделю после сеансов диализа (14,15).

Грамотрицательные бациллы вызывают 14–27% инфекций кровотока у пациентов, находящихся на гемодиализе (16,17). При лечении грамотрицательных инфекций используют цефалоспорины третьего и четвертого поколения из-за их повышенной активности в отношении грамотрицательных микроорганизмов.Цефтазидим является полезным вариантом, поскольку его можно вводить три раза в неделю после сеансов гемодиализа для достижения фармакодинамических целей (18). Имеются ограниченные данные о фармакодинамике цефтазидима у людей, но анализ фазы 3 исследования показал, что у пациентов с концентрацией цефтазидима выше МИК для 45% интервала дозирования (45% время>МИК) были достигнуты более благоприятные результаты у пациентов с госпитальным лечением. -приобретенная пневмония. При более тяжелых инфекциях или нейтропении, когда желательно использовать еще более консервативные фармакодинамические целевые значения (70% времени>МИК), лучше назначать препарат один раз в день (18).

Карбапенемы

Дальнейшие структурные модификации β -лактамного остова привели к созданию класса антибиотиков карбапенемов с более широким спектром активности, включая активность против грамотрицательных микроорганизмов, продуцирующих β-лактамазу. (7). Имипенем, первый препарат в классе, в высоких дозах вызывает судороги, поэтому его следует применять с осторожностью при поражениях ЦНС, неврологических расстройствах или заболеваниях почек. В самом крупном обзоре побочных эффектов имипенема (с участием 3470 пациентов в фазе 3 клинических испытаний) сообщалось о частоте приступов в 2% (19).В несравнительных исследованиях фазы 3, при рассмотрении конкретно пациентов с клиренсом креатинина <20 мл/мин, частота судорог составила 11,8% у пациентов, получавших дозы 0,5–1,9 г/сут, и 16,1% у пациентов, получавших >3 г/сут (20). ).

Сообщается, что риск судорог для меропенема, дорипенема и эртапенема составляет <1%, хотя все карбапенемы имеют предупреждения о судорогах, указанные в инструкции по применению (20). В то время как карбапенемы повышают риск судорог (предположительно, из-за связывания с рецепторами ГАМК), карбапенемы также резко снижают уровень вальпроевой кислоты.Хотя механизм неясен (предполагаемые механизмы включают снижение всасывания вальпроевой кислоты из-за карбапенем-индуцированного ингибирования кишечных транспортеров, снижение энтерогепатической циркуляции вальпроевой кислоты из-за снижения кишечной бактериальной β -глюкуронидазы и увеличение распределения вальпроевой кислоты в эритроцитах). 21,22]), обзор шести случаев одновременного применения карбапенема и вальпроевой кислоты показал, что концентрации вальпроевой кислоты снижались в среднем на 81,2%, при этом самая низкая концентрация наблюдалась между 4-м и 11-м днями терапии карбапенемом (21).Карбапенемы, как правило, хорошо переносятся, с общими побочными эффектами, включая осложнения в месте инфузии, диарею, тошноту и рвоту (7).

Антиметициллин-резистентный

S. Aureus Агенты

Ванкомицин

Ванкомицин является гликопептидным антибиотиком, обладающим активностью против большинства грамположительных бактерий (таблица 3). Он ингибирует синтез клеточной стенки бактерий посредством высокоаффинного связывания с единицами-предшественниками D-аланил-D-аланина клеточной стенки (23). Из-за преимущественно бактериостатического действия ванкомицин следует использовать в качестве препарата второй линии после бактерицидных β -лактамных антибиотиков, таких как цефазолин и оксациллин, при серьезных грамположительных инфекциях, таких как бактериемия MSSA.Ванкомицин выводится почками, при этом 90% экскретируется в неизмененном виде (23). На основании данных исследований на животных, in vitro и исследований на людях, исследования показывают, что соотношение AUC:MIC является фармакодинамическим параметром, связанным с эффективностью ванкомицина (24). Клинически мониторинг минимальной концентрации ванкомицина в сыворотке используется в качестве суррогатного маркера AUC для удобства и практичности; однако это не было подтверждено для большой когорты пациентов на диализе (24–26).

Таблица 3.

Спектр активности грамположительных антибиотиков и лечение инфекционных заболеваний (23)

В клинической практике ванкомицин является препаратом первого ряда для лечения серьезных метициллинрезистентных S. aureus инфекций. Увеличение использования ванкомицина привело к появлению изолятов S. aureus со сниженной чувствительностью к ванкомицину. Впоследствии Институт клинических и лабораторных стандартов снизил пограничные значения МИК чувствительности с 4 до 2 мк мкг/мл.Нацеливание на более высокие минимальные концентрации ванкомицина (15–20 мкг/мл мкг/мл) было предложено в качестве способа увеличения воздействия антибиотиков и борьбы с микроорганизмами с более высокими МИК (24).

В 1980-х годах дозу ванкомицина у пациентов на диализе рекомендовали составлять 15 мг/кг каждые 7–10 дней, поскольку во время сеансов диализа практически не удалялось никакое лекарство (25). С появлением диализных фильтров с высокой пропускной способностью клиренс ванкомицина при диализе увеличился, что привело к типичному графику дозирования три раза в неделю.У пациентов, получающих ванкомицин в течение последнего часа диализа, необходимы более высокие интрадиализные поддерживающие дозы для достижения преддиализных минимальных концентраций 15–20 мкг/мл мкг/мл (27).

Нефротоксичность является общей проблемой при терапии ванкомицином и связана с одновременным введением нефротоксинов (, например, , гентамицин, пиперациллин-тазобактам), мишенью 15–20 мкг/мл г/мл, ожирением, высокими суточными дозами и увеличенная продолжительность лечения (13).В целом адекватная доза ванкомицина у некритических больных для лечения менее серьезных инфекций имеет минимальный риск нефротоксичности (13).

Липопептиды

Даптомицин является единственным представителем класса липопептидов антибиотиков. Он проявляет зависящую от концентрации бактерицидную активность в отношении различных грамположительных бактерий за счет деполяризации мембран бактериальных клеток, вызывая потерю мембранного потенциала и последующую гибель клеток (23). Даптомицин в высокой степени связывается с белками (86% у пациентов, находящихся на гемодиализе) с низким объемом распределения, что делает его идеальным средством для лечения инфекций кровотока (28).Важно избегать применения даптомицина при легочных инфекциях, поскольку он инактивируется легочным сурфактантом.

Даптомицин в основном (78%) выводится с мочой в неизмененном виде (23). Следовательно, t 1/2 даптомицина увеличивается до 30 часов у пациентов, получающих гемодиализ, по сравнению с 8 часами у пациентов с нормальной функцией почек (28). Коррекция дозы даптомицина до 48-часового интервала дозирования рекомендуется для пациентов с клиренсом креатинина <30 мл/мин или нуждающихся в гемодиализе (28).Однако это не согласуется с типичным графиком гемодиализа три раза в неделю. Для лучшего достижения целей AUC:MIC было предложено увеличить дозу на 50% в течение 72-часового междиализного периода (29). Хотя это изменение дозы оптимизирует воздействие препарата, существует последующая повышенная вероятность превышения 72-часовой минимальной концентрации 24,3 мг/л, что связано с повышенным риском токсичности даптомицина для скелетных мышц (29). В дополнение к 30-минутной инфузии даптомицин можно вводить в течение 2 минут, что может быть полезно для ускорения обращения пациентов в диализных клиниках (28, 29).

Серьезным побочным эффектом терапии даптомицином является миопатия. В связи с этим у пациентов следует еженедельно измерять концентрацию креатинфосфокиназы (даже чаще у пациентов с нарушением функции почек) и контролировать мышечную боль или слабость во время терапии (28). Не рекомендуется одновременный прием статинов с даптомицином; тем не менее, недавняя литература предполагает, что эта комбинация была связана с численно более высокими, но не статистически значимыми показателями миопатии или повышения уровня креатинфосфокиназы, и что терапия статинами, когда это клинически необходимо, не должна препятствовать использованию даптомицина при серьезных инфекциях (30).Дополнительные редкие побочные эффекты даптомицина включают эозинофильную пневмонию и периферическую невропатию. Следует отметить, что даптомицин проявляет зависящее от концентрации лекарственное взаимодействие с рекомбинантным тромбопластином, что приводит к ложному удлинению протромбинового времени и повышению международного нормализованного отношения. Это взаимодействие можно свести к минимуму, собирая эти лабораторные значения при минимальных концентрациях даптомицина в плазме (28).

Оксазолидиноны

До выпуска тедизолида в 2014 году линезолид был единственным агентом класса оксазолидинонов.Эти бактериостатические агенты, воздействуя на P-участок 50S-субъединицы рибосомы, блокируют синтез бактериального белка (23). Оксазолидиноны не требуют коррекции дозы при почечной дисфункции, так как большинство обоих препаратов выводится непочечным путем (31). Линезолид метаболизируется посредством окисления до двух неактивных метаболитов, аминоэтоксиуксусной кислоты и гидроксиэтилглицина, которые накапливаются при ХБП с неизвестным клиническим значением (32). Потенциальные риски следует сопоставлять с преимуществами при использовании линезолида у этой популяции пациентов.Тридцать процентов линезолида удаляется посредством диализа , поэтому корректировка дозировки не требуется; однако рекомендуется вводить вторую из двух суточных доз после диализа (32).

Длительные курсы линезолида были связаны с оптическими и периферическими нейропатиями и миелосупрессией. Тедизолид не связан с этими побочными эффектами, хотя долгосрочные данные о безопасности у людей после 21 дня отсутствуют (31). Оба агента слабо и обратимо ингибируют моноаминоксидазу-А и -В, поэтому следует соблюдать осторожность при одновременном назначении серотонинергических агентов (31).

Липогликопептиды

Телаванцин, впервые выпущенный в 2009 г., был первоначальным членом класса липогликопептидов, а далбаванцин и оритаванцин получили одобрение Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в 2014 г. Эти агенты структурно родственны ванкомицину и имеют сходный механизм действия; тем не менее, они проявляют повышенную активность из-за своей способности димеризоваться и закрепляться на стенках бактериальных клеток через липофильные боковые цепи (33). Кроме того, телаванцин и оритаванцин нарушают мембранный потенциал и проницаемость, что приводит к лизису клеток (33).Липогликопептиды являются бактерицидными антибиотиками, зависящими от концентрации, и антибактериальная эффективность лучше всего коррелирует с соотношением AUC:MIC (33).

Телаванцин в основном выводится почками, при этом 76 % выводится с мочой в неизмененном виде, поэтому при падении клиренса креатинина ниже 50 мл/мин необходима коррекция дозы (34). В маркировке продукта для гемодиализа официально не указаны рекомендации по дозировке; однако режим дозирования каждые 48 часов или три раза в неделю оказался эффективным в небольшой ретроспективной серии случаев (35).В настоящее время для телаванцина выпускаются предупреждения «черного ящика» в отношении нефротоксичности и повышенной смертности у пациентов с ранее существовавшим умеренным/тяжелым нарушением функции почек (клиренс креатинина <50 мл/мин), которые лечатся от внутрибольничной или связанной с ИВЛ бактериальной пневмонии (34). ). Апостериорный анализ исследований по оценке применения телаванцина для лечения внутрибольничной пневмонии (ATTAIN) предполагает, что повышенная смертность в этой популяции пациентов могла быть связана с большим числом пациентов с грамотрицательными микроорганизмами в начале исследования. групп телаванцина и неадекватным лечением этих грамотрицательных микроорганизмов (36).Кроме того, было продемонстрировано, что у пациентов с тяжелой почечной дисфункцией или нуждающихся в гемодиализе биологическая активность телаванцина в отношении S. aureus сохраняется (37). Следует проявлять осторожность, поскольку не все различия в смертности, наблюдаемые в исследованиях ATTAIN, могут быть связаны исключительно с грамотрицательной инфекцией у пациентов с клиренсом креатинина <50 мл/мин. В клинических испытаниях телаванцин показал более высокие показатели нефротоксичности по сравнению с ванкомицином, но механизм этого неизвестен (34).

Далбаванцин и оритаванцин имеют схожие фармакокинетические характеристики, с длинными t 1/2 и линейными кинетическими профилями. Одна треть далбаванцина выводится с мочой в неизмененном виде, поэтому пациентам с клиренсом креатинина <30 мл/мин рекомендуется снижение дозы. Однако коррекция дозы у пациентов, находящихся на диализе, не рекомендуется, поскольку их фармакокинетика аналогична таковой у пациентов с ХБП легкой и средней степени тяжести (38). Оритаванцин не выводится гемодиализом и не изучался у пациентов с клиренсом креатинина <30 мл/мин или тХПН (39).

Поскольку оритаванцин является слабым ингибитором CYP2C9 и CYP2C19 и индуктором CYP3A4 и CYP2D6, его совместное введение с варфарином следует тщательно контролировать из-за повышенного воздействия препарата, поскольку сообщалось о повышении средней AUC варфарина на 31% (39). ). Примечательно, что как телаванцин, так и оритаванцин влияют на коагуляционные тесты (протромбиновое время, международное нормализованное отношение, активированное частичное тромбопластиновое время и активированное время свертывания крови), поэтому совместное введение любого из препаратов с нефракционированным гепарином противопоказано (34,40).

Аминогликозиды Антибиотики

Аминогликозиды относятся к классу бактерицидных антибиотиков, которые проявляют свое действие посредством ингибирования синтеза бактериального белка (41). Риск ото- и нефротоксичности заставил клиницистов ограничить их использование (42). Однако аминогликозиды сохранили активность в отношении многих микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью (таблица 4) и, таким образом, до сих пор играют важную роль в антибактериальной терапии. Их фармакодинамика зависит от концентрации, следовательно, соотношение пик:МИК 10–12 (43) в наибольшей степени связано с антибактериальной эффективностью при грамотрицательных инфекциях (42).Традиционно аминогликозиды дозируют, давая более низкие дозы (, например, , дозы гентамицина 3–6 мг/кг в день) (44,45), разделенные на две или три дозы в день, с мониторингом концентрации в сыворотке для корректировки дозы. более оптимальный метод дозирования, называемый «высокая доза, увеличенный интервал», объединяет дозы в большую суточную дозу (, например, , гентамицин 7 мг/кг, вводимый один раз в день) (5) для оптимизации получаемых пиковых концентраций. Поскольку высокие остаточные концентрации связаны с нефротоксичностью, интервал дозирования при использовании этого метода увеличивается до 36 или 48 часов у пациентов с нарушением функции почек, чтобы позволить им полностью вывести препарат.Эта высокая доза с увеличенным интервалом дозирования позволяет клиницистам максимизировать антибактериальную эффективность, а также ограничить токсичность, поскольку интервалы удлиняются достаточно долго, чтобы обеспечить элиминацию антибиотика до концентраций ≤1 мкг/мл г/мл (и в большинстве случаев до неопределяемых уровней). . Этот метод дозирования использует способность аминогликозидов вызывать «постантибиотический эффект» (42). То есть они продолжают оказывать антибактериальное действие даже тогда, когда концентрация препарата падает ниже МПК бактерий в течение части интервала дозирования.

Таблица 4.

Разный спектр действия антибиотиков и лечение инфекционных заболеваний (41,51) не способны эффективно удалять аминогликозиды. Высокие дозы потенциально могут вызывать длительное повышение концентрации аминогликозидов, что в конечном итоге приводит к токсичности. Для этих пациентов по-прежнему рекомендуется традиционное дозирование с тщательным терапевтическим контролем.

Пациентам, находящимся на диализе, аминогликозиды обычно назначают после каждого сеанса диализа, чтобы предотвратить значительное удаление гемодиализа (5). Интересным способом оптимизации фармакодинамики аминогликозидов при диализе может быть введение больших доз перед гемодиализом для оптимизации антибактериального уничтожения и использование повышенного клиренса, достигаемого в процессе гемодиализа, для снижения концентрации и предотвращения токсичности. Эффективность этого метода дозирования нуждается в дальнейшей оценке, но заслуживает дальнейшего изучения и рассмотрения, особенно у пациентов, находящихся на регулярном диализе и борющихся с опасными для жизни полирезистентными грамотрицательными инфекциями (46).

Фторхинолоны

Фторхинолоны широко назначались в Соединенных Штатах с момента их первоначального выпуска в конце 1980-х годов из-за их широкого антимикробного действия, доступности пероральной лекарственной формы и эффективности при различных инфекционных заболеваниях. В настоящее время на рынке США доступны пять фторхинолонов для системного применения: ципрофлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, офлоксацин и делафлоксацин. Эти бактерицидные агенты нацелены на синтез ДНК и ингибируют его путем ингибирования ДНК-гиразы у грамотрицательных бактерий и топоизомеразы IV у грамположительных бактерий (47).

Фторхинолоны обладают высокой биодоступностью при пероральном приеме и превосходным проникновением в ткани (47). Классически эти агенты относятся к категории фармакодинамики, зависящей от концентрации. Интересно, что во многих фармакодинамических исследованиях фторхинолонов сообщается, что отношение свободного (несвязанного) AUC:МИК лучше коррелирует с клиническим излечением, тогда как соотношение свободного пика:МИК измеряет потенциал возникновения бактериальной резистентности (48). На основании их фармакодинамических характеристик интервал дозирования следует удлинить, но дозу сохранить.За исключением моксифлоксацина, фторхинолоны выводятся почками и требуют коррекции дозы у пациентов с нарушением функции почек (47).

Разрыв сухожилий, периферическая невропатия и воздействие на ЦНС — это некоторые из серьезных побочных эффектов, связанных с фторхинолонами, которые побудили Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в 2016 г. альтернативные варианты лечения (49).В июле 2018 г. были добавлены изменения маркировки для всего класса, чтобы подчеркнуть риск побочных эффектов психического здоровья и гипогликемической комы (50).

У пациентов с ХБП имеет место важное, но иногда упускаемое из виду лекарственное взаимодействие между фосфатсвязывающими препаратами и фторхинолонами. Известно, что фторхинолоны хелатируются с двух- и трехвалентными катионами, что приводит к снижению всасывания антибиотиков и, возможно, к неэффективности лечения (5). Кроме того, следует с осторожностью сочетать фторхинолоны с другими препаратами, удлиняющими интервал QT, такими как противорвотные, антиаритмические и нейролептики (51).

Сульфаметоксазол-триметоприм

Сульфаметоксазол, как и другие сульфонамиды, является конкурентным ингибитором дигидроптероатсинтазы, бактериального фермента, участвующего в производстве предшественника фолиевой кислоты (51). В Соединенных Штатах сульфаметоксазол доступен только в сочетании с триметопримом, антибиотиком, который ингибирует дигидрофолатредуктазу, нижестоящий фермент, также участвующий в производстве фолиевой кислоты. Триметоприм в 20–100 раз сильнее сульфаметоксазола, поэтому для достижения фармакодинамических целей и максимальной эффективности концентрации сульфаметоксазола должны быть в 20 раз выше концентрации триметоприма (51).

t 1/2 сульфаметоксазола и триметоприма у лиц с нормальной функцией почек составляют от 9 до 11 и от 10 до 15 часов соответственно. Эти t 1/2 становятся пролонгированными при заболеваниях почек, с t 1/2 20–50 часов и 24 часа, соответственно, при ЕСКД (52–54). Один из метаболитов сульфаметоксазола, N4-ацетилсульфаметоксазол, в основном выводится почками и может накапливаться у пациентов с уремией, хотя значение этого остается неизвестным (53).

Дозу сульфаметоксазола-триметоприма следует уменьшить у пациентов с клиренсом креатинина <30 мл/мин (54). Гемодиализ умеренно эффективен для элиминации обоих препаратов, что приводит к снижению их t 1/2 до нормальных значений во время сеанса гемодиализа (54,55).

Сульфаметоксазол-триметоприм, как правило, является безопасным лекарственным средством с четко определенными побочными эффектами. Желудочно-кишечные расстройства отмечаются у 3-8% пациентов.Гематологические побочные эффекты встречаются реже, но включают мегалобластную анемию, лейкопению (особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом) и тромбоцитопению (54, 56). Триметоприм связан с гиперкалиемией, поскольку он ингибирует амилорид-чувствительные натриевые каналы в дистальных отделах нефрона дозозависимым образом. Считалось, что это чаще всего происходит у пациентов, получающих высокие дозы, но гиперкалиемия может возникать при стандартных дозах препарата, особенно у пациентов с нарушением функции почек (57).

Нефротоксический потенциал сульфаметоксазола-триметоприма у пациентов с ХБП вызывает споры (10). Некоторые авторы сообщают об ухудшении функции почек у пациентов, принимающих антибиотики (58, 59), в то время как другие не смогли подтвердить эту связь (60). Нефротоксичность, по-видимому, связана с сульфаниламидным компонентом, который может вызывать гиперчувствительный интерстициальный нефрит, канальцевый некроз или кристаллурию (10). Следует также отметить, что триметоприм снижает канальцевую секрецию креатинина, что может вызвать повышение уровня креатинина в сыворотке без какого-либо истинного изменения СКФ (10).

Назначение антибиотиков затруднено, особенно у пациентов с заболеваниями почек. Тем не менее, знание фармакологии препарата, его места в терапии, а также фармакокинетических и фармакодинамических соображений может помочь клиницисту в оптимизации использования антибиотиков, чтобы максимизировать эффективность и минимизировать побочные эффекты у пациентов. Существуют ресурсы и руководства, помогающие оптимизировать дозу (61–63), хотя рекомендации не являются последовательными или применимыми во всех клинических ситуациях (, например, , ОПП, различные методы заместительной почечной терапии) (4,64).Список ресурсов для дозирования лекарств у пациентов с ХБП был включен в дополнительную таблицу 1. Обращаясь к литературе за рекомендациями по дозированию, важно выбрать более свежие исследования с использованием аналогичных технологий диализа, поскольку стратегии фармакодинамической оптимизации и технологии диализа продолжают развиваться. . Тем не менее, практические знания в области фармакологии антибиотиков могут помочь клиницисту в принятии обдуманных решений о назначении, призванных максимизировать эффективность и ограничить побочные эффекты у особо уязвимой группы населения.

  • Copyright © 2019 Американского общества нефрологов

Изониазид и рифампицин вызывают фиброз печени через механизм, зависящий от окислительного стресса Хронический гепатит (ХГ) стал отчетливым следствием лекарственного поражения печени (ЛПП). Комбинированная терапия изониазидом (INH) и рифампицином (RMP), которая широко используется в течение длительного времени, может вызывать острую гепатотоксичность, а также инкриминируется хроническое ЛПП.Мы искали доказательства возникновения фиброза печени при длительном лечении INH-RMP в экспериментах на мышах BALB/c, подвергшихся воздействию INH-RMP.

Методы . Комбинированная доза INH (50 мг) и RMP (100 мг) на кг массы тела в день вводилась мышам перорально через желудочный зонд 6 дней в неделю в течение от 4 до 24 недель для оценки повреждения печени, окислительного стресса и развитие фиброза печени, включая демонстрацию изменений в ключевых путях и медиаторах, связанных с фиброгенезом. Результаты .Прогрессирующее увеличение маркеров активации звездчатых клеток печени (HSC), связанное с изменениями метаболизма матрикса, наблюдалось между 12 и 24 неделями лечения INH-RMP наряду с повышением содержания коллагена в печени и значительным перипортальным фиброзом. Это было связано с одновременным апоптозом гепатоцитов, увеличением печеночного цитохрома P450 2E1 (CYP2E1), активности НАДФН-оксидазы (NOX) и развитием печеночного окислительного стресса. Выводы . INH-RMP может активировать HSC посредством образования NOX-опосредованного окислительного стресса, что приводит к развитию фиброза печени.

1. Введение

Отсутствуют убедительные доказательства причинно-следственной связи между гепатотоксичностью препарата и развитием фиброза печени. Тем не менее, несколько крупных и хорошо охарактеризованных регистров лекарственных поражений печени (ЛПП), основанных на длительном наблюдении за хорошо охарактеризованными пациентами с острым ЛПП, показали, что хронический гепатит (ХГ) может возникать как отдельный исход при ЛПП [1]. –5]. Стойкие нарушения функции печени могут возникать у 5,7–18,9% пациентов с острым ЛПП [6, 7].Кроме того, гистологические и клинические признаки СН наблюдались в когортах лекарственной гепатотоксичности и тематических исследованиях [8–10]. В большинстве этих случаев частота развития хронического ЛПП увеличивается по мере увеличения периода наблюдения когорты ЛПП. В отсутствие биомаркера для точного определения ЛПП, а также одного признака эволюции в хроническую форму, хронический ЛПП остается загадочным, несмотря на его значимость. Для внесения ясности в этот вопрос необходимы хорошо спланированные экспериментальные исследования.В этом контексте важен поиск доказательств активации звездчатых клеток печени (HSCs) как ключевого игрока в CH и морфологических доказательств производства фиброза печени препаратом.

Комбинированная терапия изониазидом (INH) и рифампицином (RMP) является одной из наиболее частых причин развития острой гепатотоксичности. INH является первичным токсином, а RMP потенцирует его токсичность за счет изменения кинетики метаболитов [11, 12]. Выздоровление от острого гепатита, клинического или субклинического, обычно происходит в клинических условиях.Обычно прием препаратов после этого можно продолжать в течение первоначально запланированной продолжительности лечения в течение как минимум 6 месяцев (часто 9–12 месяцев), часто в измененной дозировке или по схеме в зависимости от наличия или отсутствия изменений функции печени [11–17]. . В целом, комбинированное лечение INH-RMP связано с явными или индолентными и скрытыми функциональными изменениями гепатоцитов в значительной группе людей, подвергшихся воздействию, и, следовательно, может вызывать активацию HSC. Ввиду затяжного характера всего процесса это приводит к фиброзу печени.Кроме того, ранее мы продемонстрировали в краткосрочных исследованиях in vivo на мышах BALB/c, что INH-RMP вызывает изменения проницаемости митохондрий и окислительный стресс наряду с апоптозом гепатоцитов [18]. Каждый из них может активировать HSC.

В настоящем исследовании мы ищем экспериментальные доказательства взаимосвязи между продолжительным лечением INH-RMP и развитием фиброза печени. Здесь мы описываем результаты исследования in vivo на мышах BALB/c, получавших INH-RMP.В этом исследовании мы хотели ответить на три важных вопроса: (1) Может ли INH-RMP вызывать фиброз печени при длительном воздействии? (2) Имеются ли какие-либо доказательства активации HSC вместе с ассоциированными изменениями белков матрикса, подтверждающие создание профиброгенной среды при длительном лечении INH-RMP? (3) Влияет ли окислительный стресс на активацию HSC и фиброз при воздействии INH-RMP, с прицелом на понимание механизма этого процесса?

2. Материалы и методы
2.1. Животные и схема их лечения

Самцов мышей (BALB/c; возраст 7–8 недель) приобретали в Национальном центре исследований лабораторных животных (NCLAS; Хайдарабад, Индия). Лечение животных и выполняемые процедуры проводились в соответствии с рекомендациями, установленными комитетом по этике животных Института последипломного медицинского образования и исследований (IPGME&R), Калькутта, Индия.

Мышей () лечили комбинированной дозой INH (50 мг) и RMP (100 мг) на кг массы тела в день через желудочный зонд 6 дней в неделю в течение 4–24 недель.Режим дозирования был основан на нашем предыдущем отчете [18]. Контрольные мыши получали равный объем носителя через зонд по той же схеме, что и мыши, получавшие INH-RMP.

2.2. Забой животных и сбор образцов

Во время умерщвления кровь получали путем пункции сердца, а образцы сыворотки хранили при -20°C для измерения аланинаминотрансферазы (АЛТ). Печень удаляли, промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и делили на четыре порции: (а) фиксировали в 10% забуференном формальдегиде (формалине) и заливали в парафин; (b) гомогенизировали в соответствующем(их) буфере(ах) и аликвоты замораживали при -70°C для биохимических анализов; (c) помещенный в более поздний (от Ambion) раствор РНК для изучения экспрессии РНК; и (d) быстрое замораживание при -70°C для использования в будущем.

2.3. Аминотрансферазы сыворотки

Активность АЛТ в сыворотке определяли с помощью коммерческого набора (DiaSys Diagnostic Systems GmbH, Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

2.4. Печеночные биохимические анализы

10% гомогенат печени использовали для определения содержания триглицеридов (ТГ) с использованием спектрофотометрического набора от Sigma Diagnostics (Сент-Луис, Миссури, США), уровней восстановленного глутатиона (GSH), окисленного глутатиона (GSSG). ), вещества, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой (TBAR), и содержание белка [19–22].Также определяли активность печеночной каталазы, глутатионпероксидазы (GPx), супероксиддисмутазы (СОД), цитохрома P450 2E1 (CYP2E1) и НАДФН-оксидазы (NOX) [23–27]. Содержание коллагена в ткани печени измеряли, как описано ранее [28].

2.5. Гистология и анализ TUNEL

Ткани печени, залитые парафином, разрезали на срезы (5  мкм мкм) и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и сириус красным для обнаружения коллагена I с использованием стандартных процедур.Анализы терминальной дезоксиуридинтрифосфат-опосредованной маркировки концов (TUNEL) с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы проводили с использованием набора для обнаружения гибели клеток in situ (Roche, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Степень повреждения, апоптоза и фиброза оценивал исследователь, который не знал об экспериментальном протоколе и классифицировал стеатоз путем определения общего процента паренхимы печени, содержащей липидные вакуоли, от 0 (<25%) до умеренной (25%). до <50%), (от 50 до <75%) и (>75%) [29].Воспаление оценивали по наличию или отсутствию воспалительных клеток, а также по очаговым случайным одиночным скоплениям воспалительных клеток, присутствующим в нескольких микроскопических полях, воспалению, воспалению и воспалению [30]. Паттерн фиброза оценивался как фиброз, фиброз или редкие перегородки, фиброз и архитектурное искажение, но не истинный цирроз, а также широко распространенный фиброз и образование узелков гепатоцитов [31].

2.6. Иммуноокрашивание

Иммуногистохимию α — актина гладких мышц ( α -SMA) выполняли из срезов печени, залитых парафином.Вкратце, депарафинированные срезы печени промывали в деионизированной воде в течение 1 минуты и в PBS в течение 5 минут с последующей пермеабилизацией в 0,1 М цитратном буфере, а затем блокировали с помощью PBS с 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA). Затем срез печени инкубировали с конъюгатом Cy3 α -SMA-антитело (C6198; Sigma) при 4°C в течение ночи. После промывки ядра окрашивали Hoechst (Sigma; 33270) в течение 5 минут, промывали PBS и монтировали с использованием реагента Prolong Gold Antifade (Invitrogen; P 36934).Предметные стекла исследовали с помощью конфокальной микроскопии (Leica, TCS SPE; Германия).

2.7. Выделение РНК и количественная ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК из ткани печени получали с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Набор для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Applied Biosystems) использовали для создания кДНК из экстрагированной РНК. Праймеры, использованные для количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR), показаны в таблице 1. qRT-PCR проводили на кДНК с использованием термоциклера StepOnePlus (ABI), наборов праймеров и мастер-микса SYBR® green PCR (Applied Biosystems). в соответствии с инструкциями производителя.Данные нормировали на экспрессию β -актина, гена домашнего хозяйства.

9139 4 5-CACCGAGATCTACGAGTTCCA-3 + + + + + + + 914 00

Праймер Праймер последовательности
NOX1 Форвард 5-CTGACAAGTACTATTACACGAGA-3

NOX1 Обратный 5-CATATATGCCACCAGATTAGGGA -3
NOX2 Форвард 5-CTTTCTCAGGGGTTCCAGTG-3
NOX2 Обратный 5-TCTTCCAAACTCTCCGCAGT-3
nox4 Форвард 5-TGAGGAGTCACTGAACTA-3
nox4 Обратный 5-TGACTGAGGTACAGCTGGA-3
р22 phox Форвард 5-TGGACGTTTCACACAGTGGT-3
р22 phox Обратный 5-TAGGCTCAATGGGAGTCCAC-3
p47 фокс Вперед
p47 phox Обратный 5-TGTCAAGGGGCTCCAGATAG-3
р67 phox Форвард 5-GCCACAGTCATGTTCAATGG-3
р67 phox Обратный 5-ACAAAAGCCTTCGGGAAAAT-3
PDGF-R β Форвард 5-AGCACCTACCTGCCTCTGAA-3
PDGF-R β Обратный 5-GCACGGCAGTGTAGAGAACA-3
α -SMA Форвард 5-ACTACTGCCGAGCGTGAGAT-3
α -SMA Reverse 5-AAGGTAGACAGCGAAGCCAA-3
TGF-β вперед 5-GTCAGACATTCGGGAAGCAG-3
TGF- β Реверс 5-GCGTATCAGTGGGGGTCA-3
COL1A1 Форвард 5-GAAACCCGAGGTATGCTTGA-3
COL1A1 Обратный 5-GACCAGGAGGACCAGGAAGT-3
ТИМП-1 Форвард 5-ATCAATGCCTGCAGCTTCTT-3
TIMP-1 Обратный 5-ATCTCCAAGTGCACAAGCCT-3
ММР2 Форвард 5-GAGAAGGATGGCAAGTATGGC-3
ММР2 Обратный 5-GCGGTCTCGGGACAGAATCC-3
ММР9 Форвард 5-GAGTGGACGCGACCGTAGTTGG-3
ММР9 Обратный 5-GTACATGAGCGCTTCCGGCACGC-3
β-актина Нападающий 5-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3
β — Актин Обратный 5-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3

NOX = НАДФН-оксидаза; PDGF-R β  = рецептор тромбоцитарного фактора роста β ; α -SMA =  α -актин гладких мышц; TGF- β  = трансформирующий фактор роста β ; COL1A1 = коллаген 1A1; ТИМП = тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы; ММП = матриксная металлопротеиназа.

2.8. Caspase Activity

Активность каспазы 3 определяли в гомогенатах печени путем измерения протеолитического расщепления специфического флуорогенного субстрата DEVD-AFC (Asp-Glu-Val-Asp) (AFC: 7-амино-4-трифторметилкумарин, соответственно; BioVision ). Результаты выражены в процентах от контроля.

2.9. Количественное определение цитокинов

Уровни печеночного трансформирующего фактора роста β -1 (TGF- β 1) оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием наборов квантикинов системы R&D.

2.10. Вестерн-блоттинг

Для вестерн-блоттинга лизат тканей готовили с использованием буфера RIPA (Cell signaling Technology, США) с коктейлем ингибиторов протеаз (Roche Diagnostics, Мангейм, Германия). Лизаты центрифугировали в течение 20 мин при 4°С. Содержание белка в супернатанте определяли с помощью белкового анализа Брэдфорда (Sigma, США). Белок в количестве 40 мкг разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) после денатурации в буфере для образцов и переносили на поливинилиденфторидные мембраны (PVDF; Thermo Fisher Scientific, США).После блокировки 5% BSA блоты зондировали следующими антителами: мышиные моноклональные α -SMA (1 : 300; Santa Cruz Biotechnology), мышиные моноклональные бета-актины (1 : 1000; Santa Cruz Biotechnology), мышиные моноклональные коллагены. 1A1 (1 : 300; Santa Cruz Biotechnology), мышиный моноклональный анти-Вах (1 : 300; Santa Cruz Biotechnology), мышиный моноклональный Bcl2 (1 : 300; Santa Cruz Biotechnology) и мышиный моноклональный цитохром c (1 : 300; Santa Cruz Biotechnology) Биотехнология). Иммунные комплексы визуализировали методом усиленной хемилюминесценции (ECL).

2.11. Статистический анализ

Результаты представлены в формате . Критерий Стьюдента использовали для оценки статистических различий между группами, а критерий Манна-Уитни использовали для сравнения гистологических данных. Значение менее 0,05 считалось значимым.

3. Результаты
3.1. Окислительный стресс и повреждение печени

Повреждение печени, вызванное длительным совместным лечением INH и RMP у мышей, оценивали путем измерения уровня АЛТ в сыворотке, а также гистологической оценки образцов печени.Мы наблюдали тенденцию к повышению уровня АЛТ в сыворотке через 4, 12 и 24 недели совместного лечения изониазидом и РМП (  МЕ/л через 4 недели лечения по сравнению с   МЕ/л у контрольных мышей;   МЕ/л через 12 недель лечения). по сравнению с   МЕ/л у контрольных мышей, и   МЕ/л через 24 недели совместного лечения изониазидом и RMP по сравнению с контролем   МЕ/л, ). Поэтому мы оценили активность печеночных антиоксидантных ферментов, таких как SOD и другие ферменты, связанные с GSH, у мышей, получавших совместно INH и RMP. Через 4 недели лечения INH-RMP активность GPx и каталазы значительно увеличилась (таблица 2).Начиная с 12-й недели и далее при совместном лечении мышей изониазидом и RMP активность печеночной SOD, GPx и каталазы значительно снижалась (таблица 2), что указывает на стойкий окислительный стресс в печени.

фактор роста
91 725
9 1669

Параметры Группы
прод 4 изониазид-РМП 4 прод 12 изониазид-РМП 12 прод 24 изониазид-РМП 24
цитозольной фракции ()
СОД (Sp активность / мин / мг белка)
GPx (Sp активность / мин / мг белка)
каталазы (Sp активность / мин / мг белка )

Мышей совместно лечили 50 мг INH и 100 мг RMP/кг массы тела через пероральный желудочный зонд в течение 6 дней в неделю в течение 4, 12 и 24 недель соответственно, а затем умерщвляли.Результаты выражены как 8 мышей в каждой группе. против соответствующего контроля; # по сравнению с лечением INH-RMP в течение 4 недель; по сравнению с лечением INH-RMP в течение 4 и 12 недель. Сокращения: Cont 4 , Cont 12 и Cont 24 являются соответствующими контролями на 4, 12 и 24 недели, в то время как INH-RMP 4 , INH-RMP 12 и INH-9090 2 9 40-9070 . представляют собой животных, получавших INH-RMP в течение 4, 12 и 24 недель соответственно.
3.2. Продолжительное лечение INH-RMP вызывает фиброз печени

Гистологические изменения в печени, вызванные длительным лечением INH-RMP, включали жировую инфильтрацию, некроз, воспаление и, что наиболее важно, фиброз печени. Стеатоз был выражен на протяжении всех 24 недель воздействия (рис. 1(а) и 1(б)).

Уровни TG в печени повышались также при лечении INH-RMP (рис. 1(c)) во временной последовательности, которая соответствовала стеатозу печени. Минимальное воспаление и отсутствие фиброза наблюдались через 4 недели, тогда как легкое или умеренное воспаление и легкий портальный фиброз в печени были очевидны через 12 недель (рис. 1(d) и 1(e)).Наблюдалось прогрессивное увеличение воспалительной клеточной инфильтрации, и в печени мышей, получавших INH-RMP через 24 недели, наблюдалась выраженность перипортального фиброза (рис. 1(d) и 1(e)).

Обработка INH-RMP индуцировала экспрессию мРНК коллагена 1A1 (COL1A1) (рис. 2(а)) через 12 недель, которая показала дальнейшее увеличение через 24 недели (рис. 2(а)). Изменения содержания гидроксипролина в печени, аминокислоты, особенно содержащейся в коллагене, происходили параллельно с индукцией экспрессии мРНК COL1A1 в разные периоды времени при одновременном лечении изониазидом и RMP (рис. 2(b)).

3.3. Лечение INH-RMP связано с активацией звездчатых клеток и ремоделированием матрикса

Мы изучили количество активированных HSC с помощью иммуногистохимии α -SMA с использованием конфокального микроскопа в разные периоды времени лечения INH-RMP, чтобы найти доказательства активации HSC. (Рисунок 2(с)).

Количество активированных HSC прогрессивно увеличивалось с течением времени и продемонстрировало взаимосвязь с продолжительностью лечения INH-RMP у мышей (рис. 2(d)). Кроме того, мы наблюдали увеличение экспрессии мРНК α-SMA в ткани печени, начиная с 12-й недели лечения INH-RMP (рис. 2(e)).

Статус пролиферации и активации HSC оценивали по экспрессии молекулы-кандидата рецептора тромбоцитарного фактора роста β (PDGF-R β ). Как показано на рисунке 3(а), экспрессия мРНК PDGF-R β показала постепенное увеличение через 12 и 24 недели, что согласуется с активацией HSC.

Затем мы оценили экспрессию тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы-1 (ТИМП-1) в тканях печени мышей и наблюдали индукцию мРНК ТИМП-1 через 12 и 24 недели лечения INH-RMP (рис. 3(b). )).ТИМП-1 синтезируется и секретируется активированными ГСК в ответ на действие фиброгенных цитокинов, в частности, на трансформирующий фактор роста β 1 (TGF- β 1) [32]. Наблюдалось значительное увеличение уровней белка TGF- β в печени после 24 недель лечения INH-RMP по сравнению с контрольными мышами (рис. 3(d)), что также было подтверждено экспрессией мРНК для TGF- β 1 (Рисунок 3(с)).

Наконец, мы также оценили экспрессию мРНК матриксных металлопротеиназ 2 и 9 (MMP2 и MMP9), молекул, связанных с ремоделированием матрикса [33], которые показали заметное усиление между 12 и 24 неделями лечения INH-RMP (рис. 3(e) и 3(е)).

3.4. Повышенный окислительный стресс связан с фиброзом печени при длительном лечении INH-RMP

Во время метаболизма INH-RMP в гепатоцитах создается значительный стресс за счет образования активных форм кислорода (АФК), которые являются потенциальным медиатором HSC активация.

Мы оценили маркеры окислительного стресса, которые выявили значительное снижение уровня глутатиона в печени (рис. 4(а)) и увеличение перекисного окисления липидов, о чем свидетельствует уровень реактивного вещества тиобарбитуровой кислоты (ТБАР) (рис. 4(в)).Все эти данные свидетельствовали о развитии окислительного стресса при лечении INH-RMP.

Принимая во внимание критическую роль CYP2E1 в окислительном стрессе при гепатотоксичности, опосредованной INH, мы измерили активность CYP2E1 в печени. Это показало прогрессивное увеличение от 4 до 24 недель лечения INH-RMP (рис. 4 (b)).

Параллельно с активностью CYP2E1 активность NOX прогрессивно увеличивалась с увеличением продолжительности лечения INH-RMP (рис. 4(d)). Чтобы дополнительно подтвердить, что INH-RMP активирует NOX в мышиной печени, было проведено исследование экспрессии мРНК субъединиц NOX в реальном времени, которое выявило значительное увеличение экспрессии различных субъединиц (рис. 4(e)).

3.5. Лечение INH-RMP увеличивает апоптоз гепатоцитов в порядке, хронологически связанном с фиброзом печени

В текущем контексте длительного воздействия INH-RMP мы изучили частоту апоптоза в ткани печени. Количество апоптотических клеток постепенно увеличивалось при лечении INH-RMP с 12 до 24 недель, что выражалось в увеличении процента TUNEL-положительных ядер (рис. 5(а)). Затем мы наблюдали зависящее от времени снижение экспрессии специфического антиапоптотического белка Bcl-2 (рис. 5(b)), который, как было показано, действует на митохондрии и предотвращает высвобождение цитохрома с и последующую активацию каспазы [34]. ].

Как показано на рис. 5(b), прогрессивное увеличение транслокации цитохрома с в цитозоле и усиление проапоптотической экспрессии Bax в разные моменты времени обработки INH-RMP с помощью вестерн-блоттинга согласовывались с результатами анализа TUNEL. Чтобы подтвердить эти данные, активность каспазы 3 оценивали в цитозольной фракции печени мышей, и у мышей, получавших INH-RMP, в период от 12 до 24 недель было выявлено прогрессирующее увеличение (рис. 5(c)) по сравнению с контрольными мышами.

Повышенная экспрессия проапоптотических молекул Bax убедительно свидетельствует о том, что лечение INH-RMP вызывает гибель клеток, опосредованную путями митохондриального апоптоза.

4. Обсуждение

Здесь мы показываем, что лечение INH-RMP в долгосрочной перспективе на мышиной модели может привести к активации HSC и фиброзу печени, действуя через механизмы повреждения клеток печени, которые включают NOX-зависимый окислительный стресс и апоптоз гепатоцитов.

Наши эксперименты подтверждают новые клинические данные о хроническом ЛПП [1–7].Изониазид вызывал 2,7% хронических ЛПП в базе данных DILIN и является важным компонентом СН-продуцирующих агентов при ЛПП [6, 35]. В этом исследовании мы подняли два исследовательских вопроса: (а) может ли INH-RMP вызывать фиброз печени при длительном воздействии, как это обычно используется в клинической практике? (b) Как INH-RMP может быть связан с механизмами восстановления клеток печени, включая окислительный стресс, апоптоз гепатоцитов и пути активации HSC, вызывающие фиброз печени?

Учитывая исследовательский характер основного исследовательского вопроса, мы разработали эксперименты на мышах in vivo с длительным воздействием INH-RMP, чтобы найти соответствующие морфологические и функциональные доказательства в этом отношении.Этот подход дает надежные данные, позволяющие предположить наличие профиброгенного состояния в печени при длительном воздействии INH-RMP.

В исследовании in vivo мы использовали комбинации INH-RMP, чтобы зафиксировать реальный сценарий противотуберкулезной терапии, когда они использовались вместе в течение не менее 6 месяцев. Комбинированная терапия INH-RMP является наиболее частой причиной острого ЛПП и лекарственной острой печеночной недостаточности в Индии [36, 37]. Из этих двух препаратов INH является основным гепатотоксическим препаратом в таких комбинациях, а RMP модифицирует кинетику образования токсических метаболитов за счет своей способности индуцировать микросомальные ферменты.Таким образом, RMP в первую очередь играет роль в усилении гепатотоксичности INH [12, 13, 18]. Дозы INH и RMP, используемые в настоящем исследовании, примерно в 10 раз превышают дозы для человека в миллиграмме на килограмм; однако они могут быть эквивалентны дозе для человека, но в расчете на площадь поверхности тела [18].

Интересным аспектом гистологии был макровезикулярный стеатоз наряду с воспалительной клеточной инфильтрацией на ранних стадиях воздействия INH-RMP, даже когда фиброз уже появился.Мы также наблюдали перицеллюлярный фиброз при длительной терапии — тип фиброза, который коррелирует со стеатогепатитом. Гистология гепатотоксичности INH-RMP оценивалась в основном при острой печеночной недостаточности и характеризуется различной степенью некроза и воспаления. В некоторых исследованиях гепатотоксичности, не связанной с печеночной недостаточностью, у человека наблюдался выраженный стеатоз [38, 39]. Ранее мы показали, что комбинация INH-RMP вызывает острую гепатотоксичность за счет митохондриальной дисфункции, стеатоза и апоптоза гепатоцитов [18].Прогрессирующее увеличение гибели клеток и воспаления в печени, наблюдаемое в настоящем исследовании, является характерными признаками, связанными с хроническим повреждением печени, ведущим к прогрессированию развития фиброза. Гибель клеток является первичным провоцирующим событием, запускающим активацию воспалительных и фиброгенных сигналов. В текущих экспериментах мы наблюдали CYP2E1-зависимый и NOX-опосредованный окислительный стресс наряду с апоптозом, линейно увеличивающимся в течение периода длительного воздействия.Оксидантный стресс стимулирует апоптоз, и мы можем задокументировать увеличение каспазы 3, цитоплазматическую транслокацию цитохрома с и реципрокную экспрессию проапоптотических белков Bax и антиапоптотических белков BCl2 в текущем исследовании, что указывает на то, что ранее описанные митохондриальные пути апоптоза активны даже в длительные периоды терапии. Кроме того, мы обнаружили повышенную экспрессию NOX, которая продуцирует АФК и стимулирует HSCs, на протяжении всего эксперимента, что позволяет предположить, что немитохондриальный путь генерации окислительного стресса также является активным.Помимо обычного фагоцитарного NOX2, нефагоцитарный NOX4 постепенно экспрессировался в печени благодаря лечению INH-RMP.

В контексте активации HSC важно, что как окислительный стресс, так и апоптоз гепатоцитов являются мощными митогенами для HSCs [40-42]. Интересно, что мы обнаружили устойчивую временную последовательность событий, которые привели к фиброзу печени. В настоящем исследовании мы наблюдали активацию HSC, которая в значительной степени зависит от окислительного стресса. Фиброз печени возникает в результате отложения коллагена I типа с одновременным ингибированием его деградации.В настоящем исследовании мы наблюдали повышенную экспрессию мРНК TIMP1 в печени из-за длительного воздействия INH-RMP на мышей. TIMP1 синтезируется и секретируется активированными HSC под влиянием TGF- β 1, уровень которого также увеличивается в печени мышей из-за обработки INH-RMP в настоящем исследовании. Таким образом, прогрессирующее нарастание окислительного стресса с течением времени коррелировало с экспрессией маркеров активации и пролиферации HSC, начиная с 12 недель воздействия INH-RMP.Это, наряду с активацией ремоделирующего матрикса (MMP2, MMP9 и TIMP1) и увеличением экспрессии мРНК COL1A1 и увеличением содержания коллагена, и, что наиболее важно, перипортальным фиброзом, очевидным при гистологическом исследовании, достигало максимальной экспрессии через 24 недели.

Сила настоящего исследования заключается в надежности, а также в новизне наборов данных, с дизайнами in vivo, направленными на решение основного вопроса об активации HSC и фиброгенезе при хронической лекарственной токсичности. Кроме того, возможность с точностью продемонстрировать соответствующие патофизиологические изменения последовательным образом, начиная с повреждения клеток и, наконец, путей, которые опосредуют описанные изменения, слишком убедительна.Мы считаем, что это первое подробное морфологическое и функциональное описание развития фиброза печени, критического компонента СН, в условиях ЛПП, и коннотации результатов довольно широки.

В заключение мы смогли продемонстрировать, что длительная терапия INH-RMP может привести к активации HSC и фиброзу печени по механизму, который зависит от окислительного стресса. Наше исследование предоставляет первоначальные экспериментальные доказательства кипящего массива клинических данных, предполагающих, что лекарства являются важными агентами при СН.

девяносто одна тысяча триста сорок-два Сокращения девяносто одна тысяча триста девяносто две
СН: Хронический гепатит
ДИЛИ: Медикаментозная повреждение печени
изониазид: Изониазид
РМП: Рифампицин
ГСК: Печеночные клетки звездчатых
CYP2E1: цитохром P450 2E1
NOX: НАДФНА оксидаза
ALT: аланинаминотрансфераз
PBS: фосфатно-буферный раствор
ТГ: триглицерид
GSH: восстановленный глутатион
GSSG: окисленного глутатиона
ТБКРС: тиобарбитуровой кислоты реактивные вещества
GPx: глутатионпероксидазы
СОД: Вс пероксид дисмутазы
Н & Е: гематоксилин и эозин
TUNEL: Терминала дезоксинуклеотидтрансфераза-опосредованной деоксиуридин трифосфат ник конце маркировка
α -SMA: α -Smooth актина
TGF-β : трансформирующий β
ИФА: иммуноферментный анализ
COL1A1: Коллаген 1A1
ТИМП: ткани ингибитор матричной металлопротеиназы
ММР: матриксных металлопротеиназ
PDGF-R β : тромбоцитарный рецептор фактора роста β
РОС: активных форм кислорода
SDS-PAGE: Додецилсульфат натрия-полиакрилам ида гель-электрофорез
ПВДФ: поливинилиденфторид
ECL: Enhanced хемилюминесценции
QRT-PCR: Количественное в реальном времени полимеразной цепной реакции
SD: Стандартное отклонение .

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.

Copyright © 2007 - 2022 Андрей Антонов